上海
膜蛋白是生命活动中的关键执行者，尤其是膜转运蛋白，负责营养物质、信号分子和代谢废物的跨膜运输，其功能依赖于在不同构象状态之间的动态转换。然而，在非天然的膜模拟环境中，蛋白的真实构象与动态行为往往受到干扰，难以反映其在细胞内的真实工作状态。近年来，尽管冷冻电镜和X射线晶体学等技术已成功解析了大量膜蛋白结构，但这些方法通常依赖于去垢剂环境或外部稳定手段，难以捕捉蛋白在天然膜环境中的动态过程。
2025年11月12日，武汉科技大学核磁共振与分子科学交叉研究院/中科院精密测量研究院杨俊教授团队与武汉科技大学段谟杰教授团队合作，在Science Advances上发表了最新研究成果：
Dynamic structures of a membrane transporter in native cellular membranes。该研究不仅解析了蔗糖转运蛋白BjSemiSWEET在天然细胞膜中的高分辨率结构，更首次在原子尺度上直接捕捉到其在生理条件下的功能性构象动态交换过程1）。
图1. 研究团队在膜转运蛋白原位动态转运机制研究方面取得进展
为了捕捉膜转运蛋白在天然膜环境中的结构和动态过程，高质量细胞膜样品的制备成为关键。针对常规方法中背景信号干扰强、目标信号信噪比低等问题，研究团队通过菌株优化、双培养基策略与膜组分分离技术的系统整合，显著抑制了背景蛋白信号，成功制备出高质量的BjSemiSWEET细胞膜样品。在此基础上，团队获得了BjSemiSWEET在天然细胞中的高质量固体NMR谱图，完成了约94%残基（81/86）的化学位移指认。特别值得注意的是，在跨膜螺旋TM1和连接环L2-3区域，研究团队发现15个残基存在两套不同的化学位移信号，表明该蛋白在天然膜环境中存在两种不同的构象状态。
为进一步解析这两个构象的三维结构，研究团队综合利用稀疏标记与全标记样品的CORD、PAR、CHHC等先进固体NMR实验，获得了大量中长程距离约束。面对距离约束归属中存在的化学位移相似性、单体/单体间界面模糊性及构象异质性等挑战，团队采用了CS-Rosetta结合模糊距离约束生成初始结构模型，并基于该模型有效排除归属模糊性。最终，研究获得了构象I的430个和构象II的419个距离约束，据此计算得到的结构主链RMSD分别达到1.5 ± 0.2 Å和2.5 ± 0.3 Å。
结构表征提供了静态的结构信息，而蛋白功能的实现则依赖于其动态行为。本研究的突出亮点在于直接实验观测并量化了两种功能构象之间的动态交换过程。通过系统的变温实验，研究团队发现Loop L2-3区域D61残基的两种构象谱峰出现平均化现象，且该平均峰在低温时消失、在高温时增强，证实此为中间交换速率下的构象交换所致，而非普通磁化转移相关峰。类似交换现象在TM1螺旋上的T18和Y21残基的2D NCA谱中也得到验证。进一步通过2D CEST-NCA和2D CSA-CODEX-NCA实验，团队对交换过程进行初步量化，测得D61残基的交换速率约为56 s⁻¹，符合中等时间尺度的交换特征。
进一步，通过全原子分子动力学模拟和增强采样方法，本研究了天然膜环境中蔗糖分子通过BjSemiSWEET的过程。构建了高精度的自由能图谱，分析得到糖分子转运动态过程中的关键中间态。从而建立完善蔗糖分子转运的分子机制模型，即“外开—摄入—双关—内开—释放”的过程。该过程中两个低能量中间态结构与实验结构高度吻合，有力的证明了固体核磁实验发现的两个结构为转运过程起到关键贡献。
此外特别值得关注的是，当将BjSemiSWEET重构至DMPC/DMPG等人工脂质体中时，仅能观测到单一构象，且蛋白丧失蔗糖转运活性。而在成分复杂、具有天然不对称性的细胞膜环境中，蛋白能够维持两种功能构象的共存与动态转换。为排除蔗糖残留可能引起的假象，团队设计了严谨的对照实验。结果表明，即使在不含蔗糖的总膜样品中，D61的双构象依然稳定存在；而向蛋白脂质体中加入远超生理浓度的蔗糖后，D61残基仍仅呈现单一构象。这些结果强有力地证明，所观察到的双构象是BjSemiSWEET在天然膜环境中的本征特性，凸显了天然膜环境对维持构象敏感型膜蛋白生理动态与功能活性的关键作用。
为推动原位固体NMR技术的发展，杨俊研究团队在过去十年间围绕样品制备、脉冲方法和结构计算开展了系统性创新（图2）：建立了高普适性的细胞膜样品制备方案（JACS Au, 2023, 3, 3412–3423），发展了高效率的固体NMR脉冲序列（J. Am. Chem. Soc., 2025, 147, 6384–6389），并提出了低模糊度的距离约束归属新策略。基于这些技术突破，团队先后解析了水通道蛋白AqpZ（Sci. Adv., 2023, 9, eadh4168；J. Am. Chem. Soc., 2018, 140, 7885–7895）、糖转运蛋白BjSemiSWEET（Sci. Adv., 2025, 11, eadv4583）和机械敏感通道蛋白MaMscL（J. Am. Chem. Soc., 2024, 146, 31472–31485）在天然细胞膜中的高分辨率结构与功能机制。这些系列工作充分证明了固体NMR技术在天然膜环境中解析膜蛋白结构的可行性与独特价值。
图2. 杨俊研究团队在膜蛋白原位固体NMR领域的系列工作
武汉科技大学副教授谢华勇、精密测量院博士生甘悦芳为共同第一作者，杨俊和段谟杰为共同通讯作者。
https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adv4583
制版人： 十一
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