Science丨绘制家族性高胆固醇血症基因LDLR编码变异的功能全景图谱

撰文丨章台柳

杂合子家族性高胆固醇血症（HeFH）——以循环性低密度脂蛋白（LDL）胆固醇升高为特征，是心血管疾病最常见且严重的遗传病因之一。早期采用降LDL疗法通过降低心肌梗死和全因死亡风险，预防动脉粥样硬化并延长寿命。清除循环中的LDL主要通过LDL受体蛋白（LDLR）：LDLR通过其配体结合域与ApoB100（LDL的主要结构成分）结合，形成复合物内吞后，LDL被降解。LDLR基因变异会破坏LDL的清除能力，约占经分子诊断的HeFH病例的80%。致病性LDLR变异的鉴定有助于精准诊断，并能实现超越常规血脂谱分析的预后评估和治疗管理，通过级联筛查识别高危亲属后还可延伸这些获益。由于早期检测致病变异能带来明确获益，HeFH被美国疾控中心列为三大"一级基因组学应用"疾病之一。然而大多数LDLR编码变异缺乏明确的临床分类；即使已分类的变异，也常缺乏变异影响的量化评估，这限制了HeFH早期诊断和患者风险分层的机会。

近日，来自多伦多大学的Frederick P Roth团队在Science杂志上发表文章

The functional landscape of coding variation in the familial hypercholesterolemia gene LDLR

研究人员首先利用染料标记LDL颗粒，该标记物在内体pH环境下荧光最强，即可量化细胞对LDL的内化能力。随后构建一套携带条形码的cDNA文库集合，包含LDLR几乎所有可能的单氨基酸变异，将文库导入内源性LDLR缺失的HeLa细胞中。使用FACS筛选出携带单一整合LDLR突变cDNA构建体且具有LDL摄取能力的细胞，通过比较筛选前后条形码的丰度变化，计算出功能评分，并将其标度化使0分和1分分别对应无义变异和同义变异的中位值。

研究人员测量了LDLR17200个可能编码替换中16677个变异体的LDL摄取功能，生成了LDLR的序列-功能图谱。生成的序列-功能图谱能较为精准地反映其生物化学特征。例如配体结合域是由7个LDLR A型（LA）模块构成，与ApoB100（LDL的主要结构成分）相互作用从而介导脂蛋白清除。每个LA模块包含三个特定的二硫键（六个半胱氨酸残基）和一个由八面体结构固定的钙离子。这些在进化中和LA模块间高度保守的残基，对LDL内化至关重要。图谱显示，对LDL摄取至关重要的LA模块（LA3-5和LA7）中，半胱氨酸残基和酸性钙离子配位残基（除提供主链羧基的残基外）均无法耐受氨基酸替换（例如LA4和LA5残基）。提供主链羧基的芳香族残基（如LA4的W165和LA5的W214）同样不耐受替换，这很可能源于它们与LDL中ApoB100的直接相互作用。令人惊讶的是，LA1、LA2和LA6的替换通常不影响LDL摄取，即LA模块之间的功能存在分化。已报道的LDLR-ApoB100复合物结构显示，LA模块3、4、5和7与ApoB100的β-带紧密结合，而LA1和LA2未结合或未解析，LA6则呈现较小的相互作用界面。这与我们的结果相一致，即LA模块1、2和6对ApoB100结合的重要性可能低于其他LA模块。为区分直接破坏LDL摄取的替换与通过降低LDLR细胞表面水平（如影响运输或导致错误折叠与降解）起作用的替换，研究人员同时大规模检测了LDLR细胞表面丰度。由此绘制的图谱涵盖了16105个（占全部可能编码替换的94%）替换。虽然具有固定构象的LA7模块在两类图谱中表现一致，但LA模块1-6中近全部（95%）氨基酸替换在丰度检测中显示耐受，而LDL摄取检测中这一比例为78%，表明LA模块1-6中的致病变异通过改变LDLR稳定性及向细胞表面运输之外的机制破坏受体功能。虽然LA1、2和6对ApoB100结合的重要性可能低于其他LA模块，但这一发现与所有7个模块均高度保守且已知携带致病性错义变异的事实存在矛盾。鉴于LDLR还与极低密度脂蛋白（VLDL）存在相互作用，研究人员在化学计量过量的外源性VLDL存在条件下检测了LDL摄取能力，获得了配体结合域中6106个（98%）氨基酸替换的功能影响数据。结果显示：LA1的替换在有无过量VLDL存在时均表现耐受；而LA2和LA6中的多个替换仅在有过量VLDL存在时才会导致LDL摄取下降。更重要的是，在VLDL存在条件下，导致LA2和LA6功能降低的替换位点与LA3-5和LA7中间源位置的功能关键位点高度吻合。即功能图谱表明LA2和LA6模块可能具有脂蛋白特异性功能，且其作用机制与LA3-5和LA7模块存在质的不同。

随后，研究人员展示序列-功能图谱及其功能评分在识别治病变异、量化HeFH风险和优化高胆固醇血症与冠心病风险推断具有非常有前景的临床应用潜力。例如，携带“功能损害型”变异（评分处于全部评分最低15百分位）的参与者具有较高的HeFH风险（OR=21.9，95%CI：14.4-33.2），该风险与携带已注释致病变异（致病/可能致病）的风险相当（OR=22.5，95%CI：16.7-30.4）。携带“功能正常型”变异（评分处于最高70百分位）的参与者HeFH风险（OR=1.3，95%CI：1.1-1.5）低于所有LDLR变异携带者的整体风险（OR=1.6，95%CI：1.4-1.8），与携带良性变异（良性/可能良性）参与者的风险持平（OR=1.3，95%CI：1.1-1.5）。功能评分还能对已知致病变异携带者进行风险分层。相较于所有致病变异携带者，携带"功能损害型"致病变异的HeFH风险（OR=44.3，95%CI：27.4-71.5）比携带"功能正常型"致病变异者（OR=10.5，95%CI：6.0-18.3）升高约4倍。此外，LDLR功能评分在不同族裔和祖源人群中均具有改善HeFH风险推断的潜力。

总的来说，这项研究通过大规模变异来系统评估来几乎所有可能的LDLR单氨基酸替换对LDL摄取和细胞表面丰度的影响，构建成的序列-功能图谱不仅反映了当前对LDLR功能的认知，更揭示了意想不到的生物化学机制，并为临床变异解读和改善HeFH患者风险评估提供了潜在解决方案。

https://www.science.org/doi/10.1126/science.ady7186

制版人： 十一

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