《食品科学》：华南农业大学刘晓娟教授等：虾青素立体异构体与胰腺α-淀粉酶的相互作用

虾青素（AST）是一种含氧类胡萝卜素，化学名为3,3’-二羟基-4,4’-二酮基-

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胰腺

华南农业大学食品学院的劳雨露、郑钦生、刘晓娟*等人探究了左旋和右旋AST对PPAA的抑制效果及其相互作用机制，分别从雨生红球藻和红法夫酵母中分离制备左旋和右旋AST，然后采用体外酶活性测定明确AST异构体对PPAA的抑制效果，进一步通过CD光谱、同步荧光光谱（SFES）、内源荧光光谱（IFES）和分子对接等技术研究AST异构体对PPAA的抑制机制。研究结果有助于阐明AST异构体作为酶抑制剂预防高血糖机制，同时对于开发降血糖相关的保健食品和药品具有重要的指导意义。

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左旋和右旋AST的制备和构型鉴定

1.1 左旋和右旋AST的分离制备

雨生红球藻是自然界中左旋AST含量最高的生物来源，已成为食品和药品领域获取AST的主要途径；红法夫酵母的AST主要是右旋构型，目前在饲料添加剂领域广泛使用。因此这两种原料是制备左旋和右旋AST的优质原料。由于藻源AST主要以酯化态形式存在，酵母源主要是游离形式，因此藻源AST提取过程的皂化工艺必不可少。通过HPLC分析，藻源AST粗提物中99%为酯化态（图2A），经过皂化后，绝大多数的酯化态转化为游离态，且产生的副产物较少有利于后续的分离纯化（图2B），再经硅胶柱层析，成功纯化AST，采用HPLC分析（图2C）并依据图2D标准曲线计算，结果显示纯度大于94%。同时，酵母源AST经过有机溶剂提取已富集大量AST（图2E），较少的杂质经过柱层析即可获得纯度大于96%的AST（图2F）。因此，皂化-有机溶剂萃取-硅胶柱层析的经典结合方法成功制备了高纯度AST，为后续活性研究提供了足量高质量的原料。

1.2 左旋和右旋AST的构型鉴定

左旋和右旋AST仅手性存在差异，因此必须通过手性柱来区分立体构型。如图3所示，雨生红球藻和红法夫酵母制备的AST的出峰时间不同，表明它们存在立体构型差异。已知人工合成全反式AST是由左旋、内消旋和右旋AST 3 种立体异构体（1∶2∶1）组成，并且最左边和最右边的峰分别对应左旋和右旋AST。由此证明藻源AST是左旋构型，酵母源AST是右旋构型。综上所述，本研究实现了高纯度游离态左旋和右旋AST的精准分离与制备，为后续开展深入研究奠定了坚实的物质基础。

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左旋和右旋AST对PPAA活性的抑制作用

PPAA是一种淀粉水解酶，它在淀粉水解为葡萄糖的途径扮演着重要角色。越来越多研究表明抑制PPAA活性可作为预防高血糖的一种有效手段，因为它可以降低淀粉的消化速率和肠道对葡萄糖的吸收。因此，本研究希望通过探究AST异构体对PPAA活性的抑制效果和作用机制，从而挖掘AST预防高血糖的潜力。结果表明，AST立体异构体对PPAA活性具有明显的抑制作用，且呈浓度依赖性（图4）。当AST质量浓度为10 μg/mL时，左旋和右旋AST的抑制率分别为8.78%和9.47%；当质量浓度增加至33 μg/mL时，抑制率分别显著提升至37.42%和38.79%。尽管2 种立体异构体的抑制率随质量浓度升高显著增加，但二者之间并未表现出显著差异（P＞0.05）。先前研究报道了AST通过抑制PPAA和α-葡萄糖苷酶活性发挥降血糖功效，本实验证实左旋和右旋AST对降血糖关键调控酶PPAA具有显著抑制作用，且抑制效应未呈现立体构型差异。

AST立体异构体通过抑制PPAA实现降血糖功效与其分子结构特征密切相关，如中间的长共轭双键、端环上的羟基和酮基。目前已有研究表明，左旋和右旋AST是否呈现立体构型特异性与其发挥的功效有关，如左旋和右旋AST在抗氧化、抗衰老和免疫调节功能方面具有显著差异，在抗肿瘤和本研究发现的抑制PPAA活性方面未展现出显著差异。由于AST存在立体构型归因于端环上连接羟基的C3和C3’两个手性碳原子，因此推断若端环上的羟基不是发挥活性的主要因素，其在立体空间的（3S,3’S）或（3R,3’R）结构并不改变活性大小。另一方面，若端环上的羟基对发挥活性至关重要，C3和C3’的羟基（—OH）在立体空间上的不同便会带来活性的显著差异。类似地，非没食子化茶素的立体异构体在自由基清除活性上也未表现出显著差异，主要由于这些茶素酚羟基（—OH）的位置和数量在立体异构体之间保持一致，且立体障碍对其抗氧化活性的影响较小。由于该方面的研究还十分有限，更深入的原因还有待揭示。后续通过AST立体异构体与PPAA之间的结合模式、构象变化及能量传递等微观相互作用，旨在阐明其抑制酶活性的潜在机制。

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左旋和右旋AST对PPAA构象的影响

酶的活性与其二级结构密切相关，抑制剂通常通过与酶的活性中心或别构位点结合，改变酶的构象，从而抑制其催化功能。AST作为一种天然类胡萝卜素，具有独特的化学结构，假设其通过与PPAA的活性中心或别构位点相互作用，改变其构象，进而抑制酶的活性。因此，采用了CD和SFES两种技术，深入分析AST立体异构体与PPAA之间的相互作用及其对PPAA构象的影响。CD光谱已被广泛用于研究蛋白质的构象，可通过远紫外区主链构象的特征反映蛋白质二级结构（α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲）含量的变化。

通过记录PPAA在有或无AST立体异构体存在时的CD图，观察AST结合对PPAA二级结构的影响。结果如图5和表1所示，天然PPAA在207 nm处出现一个最低的波谷，通过软件计算得到其二级结构为7.57% α-螺旋、43.40% β-折叠、20.17% β-转角和36.40%无规卷曲，表明PPAA的二级结构主要是β-折叠，这与前人的研究结果一致。当PPAA结合了AST立体异构体后，其CD光谱出现轻微波动，对二级结构含量中的β-折叠产生微弱的影响，其中左旋和右旋AST分别提高到43.90%和43.70%。AST立体异构体与PPAA的结合未对蛋白二级结构产生显著影响，表明其结合过程未破坏PPAA原有的二级结构特征，从而有利于PPAA维持其原有的生理功能，与Ag＋和Pb2＋可在不影响脯氨酰内肽酶二级结构的前提下抑制其活性的研究结果相似。

为进一步深入探究配体对蛋白质构象变化的影响，采用SFES分析生色氨基酸微环境的极性变化。SFES仪能够在特定波长间隔内同时扫描激发波长和发射波长，并通过光谱中最大发射波长位置的变化，反映相互作用对生色氨基酸周围环境极性的影响，当激发波长和发射波长的波长间隔（Δλ）固定为15 nm或60 nm时，可分别显示出反映色氨酸（Tyr）和酪氨酸（Trp）残基微环境的特征光谱。基于SFES技术的这一特性，本研究探讨了AST立体异构体对PPAA微环境的影响。如图6所示，Tyr和Trp残基分别在296 nm和340 nm出现最大发射波长。随着左旋和右旋AST的加入，Trp残基的最大发射波长均发生了微弱的位移（1 nm以内），而对Tyr残基微环境没有影响，表明AST立体异构体的结合位点可能位于Trp附近。综上所述，AST立体异构体与PPAA的相互作用不会显著影响PPAA的微环境。由此可见，CD光谱和SFES一致表明AST立体异构体与PPAA的相互作用不会对蛋白构象造成明显改变。

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左旋和右旋AST与PPAA的模拟结合

酶的抑制机制通常分为竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争性抑制。因此，为了进一步明确其抑制机制，通过分子对接模拟进一步探究了AST立体异构体与PPAA的结合模式及其对PPAA活性的影响，并与PPAA的特异性抑制剂（阿卡波糖）进行对比分析，以便进一步明确其结合位点、相互作用力以及具体抑制机制。如表2所示，PPAA与左旋和右旋AST具有相近的结合自由能，分别为—9.4 kcal/mol和—9.2 kcal/mol。分子对接结果显示，AST立体异构体均与PPAA的催化中心结合（图7A、B），并且它们之间的结合位点较为靠近（图7C），从而推断C3和C3’两个手性碳原子带来的立体构型并未影响AST-PPAA的相互结合。进一步来看，AST立体异构体的主要相互作用力为范德华力、氢键和疏水作用力，并且均与Glu233残基形成氢键。不同之处在于右旋AST的氢键键长稍短于左旋AST 0.9 Å，同时右旋AST具有较多的相互作用氨基酸残基，但是这些变化并未带来AST-PPAA结合的显著改变。同时，Trp59残基参与了AST立体异构体与PPAA的相互作用，这可以解释2.3节中Trp最大发射波长的轻微位移变化。

根据先前的X射线衍射晶体学鉴定，Asp197、Glu233和Asp300是PPAA活性中心的3 个关键催化残基，分子对接结果显示，AST立体异构体与PPAA的结合位点涉及这些关键残基（表2），并且与Glu233形成氢键。这一结合模式与阿卡波糖的结合位点相似（图7C），阿卡波糖已证实通过竞争性结合酶的催化中心发挥抑制作用，因此，推断AST异构体同样与PPAA催化口袋结合，发挥竞争性抑制作用。此外，已有研究表明天然产物通过与PPAA催化中心结合抑制其活性。例如，结合多酚中的牡荆素、对羟基苯甲酸通过与PPAA的催化残基Asp197、Glu233和Asp300形成氢键，发挥竞争性抑制作用；对香豆酸通过与PPAA活性位点Asp300形成氢键，发挥竞争性抑制作用；类似的，芦丁、槲皮素和山柰酚通过与α-淀粉酶的主要活性位点形成氢键或π-阴离子相互作用，抑制其活性。这些研究结果与本研究分子对接结果高度一致，进一步支持了AST异构体与PPAA的结合模式，后续有待更多的实验验证进一步确认这一结合模式。

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左旋和右旋AST与PPAA相互作用的荧光猝灭机制

蛋白质发色团周围微环境的变化可归因于小分子与蛋白质的结合，反映这些变化的荧光猝灭已被广泛用于评估活性成分与PPAA之间的相互作用 。PPAA内部含有17 个Trp残基，由于荧光团Tyr、Trp和苯丙氨酸对周围环境的极性很敏感，因此，为了研究AST异构体与PPAA之间的相互作用，采用IFES测定分子间相互作用信息，记录了添加AST异构体前后PPAA的荧光强度。结果如图8所示，在加入AST立体异构体后，334 nm处的荧光发射峰明显下降，并且表现出浓度依赖的猝灭效果，表明AST立体异构体与PPAA发生相互作用导致蛋白荧光猝灭。与此同时，位于280 nm处的肽链荧光峰也随着AST质量浓度的增加而增强，表明二者的相互作用影响了蛋白质结构，由于其最大发射波长没有出现位移变化，因此推断这种影响比较轻微。该结果与前面的CD和SFES结果一致，再次说明AST-PPAA的相互作用未对蛋白构象造成明显改变。

荧光猝灭机制通常分为静态猝灭（基质猝灭剂与荧光团形成复合物）、动态猝灭（猝灭剂与荧光团碰撞诱导）以及这两种形式的组合。为了进一步阐明AST立体异构体和PPAA的荧光猝灭机制，采用Stern-Volmer方程进行计算分析，如图9和表3所示。在这2 个温度下，猝灭曲线均表现出良好的线性关系，表明存在单一的猝灭机制。静态和动态猝灭机制可以通过Stern-Volmer猝灭常数（Ksv）随温度的变化区分。对于动态猝灭，温度升高会增强分子间的碰撞，从而增加猝灭常数；对于静态猝灭，温度升高可能会使复合物不稳定，从而降低猝灭常数。

研究显示，随着温度从298 K升高到310 K，左旋和右旋AST的Stern-Volmer猝灭常数Ksv分别从1.65×104、2.15×104 L/mol下降到1.56×104、1.92×104 L/mol。左旋和右旋AST的Ksv都随着温度升高而下降，表明AST立体异构体与PPAA发生结合时，静态猝灭是主要的荧光猝灭机制。此外，静态猝灭的猝灭速率常数Kq通常远高于2.0×1010 L/（mol·s），两种AST异构体的Kq都远高于生物分子的最大散射碰撞猝灭常数，因此再一次支持静态猝灭机制的结果。这一结果与前人的研究报道一致，绿豆皮膳食纤维中提取的纯化结合型多酚对PPAA的荧光猝灭效应同样遵循静态猝灭机制。综上所述，通过荧光猝灭实验和Stern-Volmer方程分析，确认了PPAA与AST立体异构体之间存在静态猝灭机制。在此基础上，进一步测定结合位点数、结合常数、热力学参数和结合力，有助于深入理解PPAA与AST立体异构体的结合特性。

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左旋和右旋AST与PPAA相互作用的结合常数和结合位点数

结合常数和结合位点数是研究小分子与蛋白质相互作用中重要的定量数据，测定结合常数可以提供小分子与蛋白质之间的结合强度，研究结合位点数有助于了解它们之间的结合机制以及小分子间相互取代的机理和可能性 。为了深入探究AST异构体与PPAA之间的相互作用，本研究采用双对数方程（4）对荧光强度计算AST异构体与PPAA相互作用后的结合常数（ K A ）和结合位点数量（ n ）绘制lg（（ F 0 — F ）/ F ）与lg [ Q ]的直线图（图10），线性截距和斜率分别代表结合常数的对数和结合位点数量。计算结果如表4所示，AST-PPAA的 n 接近于1，表明AST立体异构体在PPAA中均只有一个结合位点。此外，AST-PPAA的 K A 位于10 2 ～10 3 L/mol之间，可以推测AST立体异构体对PPAA具有较弱的结合亲和力。左旋和右旋AST在298 K时的 K A 分别为6.17×10 2 、6.78×10 2 L/mol，表明二者对PPAA具有相等的结合亲和力。这种结合亲和力强弱的趋势与酶活性抑制效果相一致，与之前研究两种青稞多糖、苦丁冬青苦丁茶咖啡酰奎尼酸类物质对PPAA的抑制的结果 相似。

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AST异构体与PPAA相互作用的热力学参数和相互作用力

一般来说，配体与蛋白质的结合主要涉及4 种类型的非共价作用力，包括氢键、疏水作用、静电引力和范德华力 。这些作用力的相对贡献决定了配体与蛋白质结合的特性和稳定性。热力学参数（如焓变Δ H 、熵变Δ S 和吉布斯自由能变Δ G ）是判断这些作用力类型的关键依据。焓变（Δ H ）主要反映氢键和静电作用的贡献，熵变（Δ S ）则与疏水作用密切相关 。在本研究中，由于AST异构体与PPAA的结合模式存在区别，它们在热力学参数上可能表现出不同的特征。因此对热力学参数进行详细分析，从而进一步揭示AST异构体与PPAA之间的作用力类型及其结合机制。

如表5所示，左旋和右旋AST与PPAA相互作用的ΔG全为负值表明两者与PPAA的结合过程是自发。此外，焓变ΔH分别为—53.77、—63.51 kJ/mol，熵变ΔS分别为—127.00、—158.92 J/（moL·K）。AST立体异构体ΔH和ΔS均呈现负值，表明驱使它们与PPAA发生结合的主要相互作用力是氢键和范德华力。然而，右旋AST的ΔH和ΔS均小于左旋AST，这种热力学参数的差异暗示右旋AST可能与更多的氨基酸残基相互作用，这在分子对接的结果中得到了验证。值得注意的是，本研究采用荧光猝灭法获得的热力学参数与已有文献报道的方法学结果一致。例如，Sun Nan等在研究绿豆皮膳食纤维提取的结合多酚对PPAA的抑制机制时，通过荧光猝灭实验分析了热力学参数，结果与分子对接和差示扫描量热法的结果一致。Le和覃亚娟等的研究同样通过荧光猝灭实验分析了黄酮类化合物和多酚与PPAA的相互作用。这些研究结果表明，荧光猝灭实验是分析PPAA与小分子相互作用的热力学参数的有效方法。

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结论

研究围绕左旋和右旋AST对降血糖关键调控酶PPAA的抑制效果及其相互作用是否存在立体特异性展开探讨，从雨生红球藻和红法夫酵母中分离制备的高纯度左旋和右旋AST均能明显抑制PPAA活性，但抑制效果没有显著差异。AST异构体并不是直接对PPAA蛋白构象造成显著变化的角度影响酶活性，左旋和右旋AST的结合位点均位于PPAA的催化口袋，与酶抑制剂阿卡波糖的结合位点相同，并且与酶催化中心的关键氨基酸残基Asp197、Glu233和Asp300具有相互作用。其中Glu233残基与AST立体异构体均形成了氢键，其中右旋AST的键长比左旋AST短0.9 Å。结果表明AST异构体抑制PPAA活性的作用机制是竞争性结合底物的催化位点。此外，AST异构体通过静态猝灭机制与PPAA结合，均通过氢键和范德华力与PPAA相互作用，右旋AST的热力学参数稍低，且与稍多氨基酸残基发生相互作用，最终仍具有相近的结合亲和力，从而展现相似的PPAA抑制活性。本研究为AST作为预防高血糖的天然产物提供了重要的理论依据，并为开发新型酶抑制剂和功能性食品奠定了科学基础。未来研究可通过分子动力学模拟进一步探索ASTPPAA相互作用的动态行为，以及通过动物实验深入阐明AST异构体体内降血糖作用效果，从而更全面地揭示AST立体异构体与关键调控酶的相互作用以及发挥降血糖的潜力。

作者简介

通信作者

刘晓娟，华南农业大学食品学院教授，2008年博士毕业于暨南大学。2015年7月至2016年7月，国家公派到美国马萨诸塞州立大学（全美博士学科点食品排名第一）做访问学者一年，主要从事食品功能因子活性评价及作用机理、食品生物化学与分子生物学、递送体系提高活性物的生物利用率、功能食品研发等领域的研究工作。广东省高等学校“千百十工程”校级培养对象，华南农业大学2020年“三育人”教书育人先进个人、华南农业大学“第一批卓越青年教师百人计划、”华南农业大学“青年骨干教师”，广东省企业科技特派员、农村科技特派员。在教学方面，系统讲授《食品化学》、《功能食品学》等课程，负责省级一流（课程思政）本科课程；在科研方面，近年来，主持2项国家自然科学基金项目、1 项教育部博士点基金项目、4 项广东省自然科学基金项目、1 项广东省科技计划项目、1 项广州市重点研发项目、1 项广州市科技计划项目、1 项广东省教育厅项目、5 项企业横向课题等10多个项目，主要参与国家级、省市级各类项目30多项；以第一作者和通信作者发表论文40多篇，其中SCI&EI收录30多篇；申请国家发明专利6 项。

第一作者

劳雨露，华南农业大学在读硕士研究生，研究方向为食品化学及功能性食品。

本文《虾青素立体异构体与胰腺α-淀粉酶的相互作用》来源于《食品科学》2025年46卷第17期31-42页，作者：劳雨露, 郑钦生, 赵凯欣, 肖杰, 曹庸, 刘晓娟。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250303-007。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑：安宏琳；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网