APPS | 兰州百合多糖-Fe (III)配合物的合成与功能分析：迈向生物可利用铁补充剂的一步

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Introduction

兰州百合（Lilium davidii var. willmottiae (E.H. Wilson) Raffill）作为川百合的一个变种，属于百合科百合属，主要在中国甘肃省兰州市周边地区种植。百合的主要成分中，多糖（Lilium polysaccharides，LLP）因其潜在的生物功能性而受到越来越多的关注，对其结构特征和生物活性进行了广泛研究。铁是人体必需的微量元素，在酶促反应、细胞代谢、氧气运输以及能量代谢中发挥着至关重要的作用。尽管之前的研究已经确立了百合多糖（LLP）的多功能特性，包括抗氧化、抗菌和抗衰老活性，但在通过金属络合对LLP进行结构修饰以及系统评估多糖-铁络合物的进一步应用方面仍存在显著研究空白。值得注意的是，目前尚未有研究调查兰州百合衍生的多糖-Fe (III) 络合物，其结构-功能关系完全未被探索。为了弥补这些空白，本研究旨在：1）通过比较评估3种不同方法优化LLP的提取/纯化；2）表征合成的LLP-Fe (III) 络合物的理化、热和结构特性；3）通过体外消化模型评估铁的生物利用度和稳定性。这些研究结果有望为百合资源的新型高价值应用提供新的思路，并为新型铁补充剂的开发提供见解。

Results and Discussion

LLP的提取与纯化

为了比较不同提取技术的效率，本研究采用热水提取、超声辅助提取和酶辅助提取三种方法从兰州百合中分离多糖。结果显示，超声辅助提取法产率最高，这可能归因于其增强了百合多糖从细胞壁中释放、扩散和溶解到溶剂中的能力。获得的粗多糖经过进一步纯化，以研究其结构和药理活性。柱层析，包括阴离子交换层析和凝胶过滤层析，是常用的纯化技术之一。本研究中，通过不同方法提取的多糖首先使用DEAE-52柱进行分离，采用NaCl溶液梯度洗脱，产生了初级洗脱峰（图1A1-C1）。这些峰随后被收集，并使用Sephadex G-100柱进行进一步纯化。得到的层析图显示每种多糖都呈现对称的单一峰（图1A2-C2），表明它们具有均一性。这也证实了这些提取方法所获得多糖的一致性和纯度。

图1 LLP在DEAE-52纤维素柱上的纯化图以及在热水（A）、超声辅助（B）和酶辅助（C）方法下LLP在Sephadex G-100柱上的纯化曲线

分子量

图2显示，通过热水、超声辅助和酶辅助方法提取的多糖层析图均呈现单一对称峰，表明每种多糖均由均一的单糖组成。通过热水、超声辅助和酶辅助方法获得的多糖分子量分别为1.132×104、1.103×104和3.265×104 g/mol，多分散性指数分别为2.743、1.774和3.963。这些结果表明，兰州百合多糖具有相对较低的分子量和较窄的分子量分布。

图2 热水（A）、超声辅助（B）和酶辅助（C）方法提取的LLP的分子量分布

LLP的FT-IR光谱和UV-vis光谱分析

通过FT-IR光谱反映了通过不同方法提取的LLP的特定官能团和糖苷键。如图3A所示，三种LLP的FT-IR光谱在主峰、位置和强度上总体相似。3400 cm-1附近的强吸收带对应于羟基的伸缩振动，而2900～3000 cm-1的吸收带则代表多糖的C-H伸缩振动。1700和1600 cm-1处的吸收峰与多糖中羧基产物的C=O不对称和对称振动有关，表明存在糖醛酸。在热水和超声辅助提取的多糖中，1420和1250 cm-1附近的谱带被归因于C-O伸缩振动和O-H变形振动。类似地，1100～1000 cm-1范围内的1067和1031 cm-1处的谱带与多糖中的吡喃糖环连接，这是由C-O-C的不对称振动引起的。三种不同多糖的UV-vis光谱显示，在260～280 nm处未观察到吸收峰（图3B），这表明不同方法制备的样品中不含蛋白质或核酸。

图3 热水、超声辅助和酶辅助方法提取的LLP的结构特性

LLP-Fe (III)络合物的制备

根据三种提取方法获得的LLP的产率、均一性、分子量和化学结构，选择超声辅助提取法制备LLP及其铁螯合物。通过单因素实验和Box-Behnken响应面法确定了LLP-Fe (III) 的最佳制备条件，包括反应温度61.10 °C、pH 6.92和反应时间1.38 h。这些条件下Fe3+的产率为7.19%，高于杜仲多糖-Fe (III) 络合物中6.1%的铁含量，表明LLP-Fe (III) 具有高结合铁的能力。在这些条件下，LLP-Fe (III) 络合物成功制备，呈无臭无味的红棕色粉末（图4A）。为确认LLP-Fe (III) 络合物中不含游离Fe3+，以FeCl₃作为对照进行检测。将LLP-Fe (III) 络合物和对照分别加入H₂O、NaOH、KSCN和K₄[Fe(CN)₆]溶液中时，对照组出现不同颜色的沉淀，而LLP-Fe (III) 络合物溶液中没有沉淀（图4B）。这一结果证实LLP-Fe (III) 形成稳定的螯合物，不含未结合的Fe3+。

图4 合成的LLP-Fe (III) 络合物（A）和LLP-Fe (III) 络合物中游离Fe³⁺的验证（B）

LLP-Fe (III)的分子量和单糖组成分析

通过SEC-MALLS分析LLP-Fe (III) 的分子量，结果如图5B所示。LLP-Fe (III) 的层析图上观察到一个形状良好、单一对称的峰，表明获得的LLP-Fe (III) 由均一的单糖组成。单糖标准品、LLP和LLP-Fe (III) 的层析图如图5D和E所示。根据标准品，LLP和LLP-Fe (III) 的组成相似，两者主要单糖均为甘露糖（Man）和葡萄糖（Glu）。LLP和LLP-Fe (III) 的组成一致，但两种样品间的摩尔比不同。LLP中甘露糖和葡萄糖的比例为1.11∶1，而LLP-Fe (III) 中为1∶1.23，这可能与铁与甘露糖残基相互作用导致甘露糖含量降低密切相关。

图5 LLP（A）和LLP-Fe (III) 络合物（B）的分子量分布，以及单糖组成（标准单糖的离子层析图（C），LLP（D）和LLP-Fe (III) 络合物（E）中的单糖组成）

LLP-Fe (III)的热分析

热重分析（TG）和微分热重分析（DTG）常用于反映多糖的重量变化。图6显示了LLP和LLP-Fe (III) 在40至650 °C范围内的TG和DTG光谱。LLP和LLP-Fe (III) 络合物的失重特性存在一些差异。LLP显示出两个失重阶段，第一个失重峰出现在48.87 °C，失重率为9.32%，主要由游离水和结合水的损失引起。随后，TG曲线从195.87 °C到344.21 °C表现出快速且最大的失重，在245.54 °C时达到61.28%的失重率，表明低分子量和高分子量物质的分解。超过此温度后，失重变化极小（图6A）。而LLP-Fe (III) 表现出三个失重阶段（图6B）。第一阶段，在69.1 °C出现7.3%的小幅失重，归因于水分和挥发性化合物的减少。随后，在250～260 °C之间，由于脱羧和热分解，重量略微减少约1.8%。第三阶段，在288～325 °C之间发生5.9%的失重，这是由于碳化引起的。此后，LLP-Fe (III) 的重量在325～650 °C之间保持相对稳定在约68%的水平。这些结果表明，LLP-Fe (III) 的热解温度更高，其热稳定性优于LLP。

图6 LLP（A）和LLP-Fe (III) （B）的TG和DTG热重曲线图

LLP-Fe (III)的FT-IR分析

通过FT-IR分析多糖的特殊官能团和糖苷键，以反映其结构。先前观察到的LLP和LLP-Fe (III) 红外光谱显示，在1000～4000 cm-1附近的强吸收峰位置和形状相对相似，表明Fe3+螯合未影响化学官能团。然而，LLP-Fe (III) 样品中各种吸收峰的波数向较低波数移动。这一现象可能归因于FeCl3的共热合成。此外，699.5 cm-1处的峰位变化以及554.3 cm-1处新峰的出现，进一步证明了LLP与铁离子结合，成功形成了Fe-OOH。这一结果表明Fe3+与百合多糖上的羧基和羟基螯合，形成了新的β-Fe-OOH键和稳定的多糖铁络合物。在人心果、天门冬、金针菇和豌豆衍生的多糖-Fe (III) 中也发现了类似的β-Fe-OOH特征吸收信号。

LLP-Fe (III)的微观结构分析

为了评估引入铁对LLP微观形态的影响，本研究采用SEM观察了多糖-Fe (III) 中Fe3+铁的结构和分布。LLP和LLP-Fe (III) 在500倍和5000倍放大下的SEM图像显示，表面形态（包括尺寸和形状）发生了显著变化。本研究中，LLP样品呈现多孔疏松结构，具有不规则的蜂窝状（图7A-B）。相比之下，LLP-Fe (III) 络合物的特点是均一分散，由众多小颗粒组成（图7C-D）。

图7 LLP（A-B）和LLP-Fe (III) 络合物（C-D）的SEM图像

此外，与LLP样品相比，LLP-Fe (III) 络合物的平滑度显著增强。这种形态变化可归因于铁与多糖相邻基团的结合以及多糖分子链之间的分子间交联，导致构象改变，并进一步影响其理化和生物活性。除了结构，LLP-Fe (III) 络合物还表现出优异的抗氧化活性，基于DPPH和ABTS自由基清除率。LLP-Fe (III) 络合物在1 mg/mL浓度下的DPPH和ABTS自由基清除率分别为70%和65%，高于人心果和冬虫夏草菌丝体多糖-Fe (III)，表明LLP-Fe (III) 络合物具有更好的抗氧化活性。

Fe³⁺在体外消化模拟中的释放

人体摄入铁补充剂后，Fe3+在胃肠道环境中释放，并在小肠中吸收。然而，胃肠道中Fe3+的过量释放可能导致一系列副作用，如代谢紊乱、铁中毒和其他健康问题。因此，控制铁的释放对于维持健康至关重要。本研究通过模拟人体胃肠道环境，分析了LLP-Fe (III) 络合物中铁离子的释放过程。图8显示了LLP-Fe (III) 在胃肠道消化过程中离子水平的变化。在模拟胃消化过程中，30 min时释放了9.45%的Fe3+，在90 min时显著增加到18.0%，并在120 min时达到19.6%。这一结果表明胃酸破坏了LLP-Fe (III) 的结构，使得大量Fe³⁺可供肠道吸收。

图8 LLP-Fe (III) 络合物在模拟胃肠道消化过程中铁的释放率

在模拟肠道消化中，前60 min内Fe3+的初始释放率为10.8%，随后在60～210 min内缓慢下降至4.5%，达到相对较低的水平。Fe3+释放的减少可能与弱碱性肠液中Fe(OH)3的形成有关，因为OH⁻离子会与Fe3+结合。这一结果与人心果和蒜多糖-Fe (III) 络合物中观察到的消化现象一致。所有这些结果表明，多糖-Fe (III) 络合物在胃条件下不易被破坏，并将大部分铁离子输送到肠道以实现更好的吸收和利用。综上所述，LLP-Fe (III) 胃肠道中表现出强大的耐受性，因此它可能是一种有前景的铁补充剂，具有更好的吸收性和稳定性。

Conclusion

本文以兰州乳杆菌多糖为原料，合成了一种新型的LLP-Fe (III)配合物，其Fe (III) 量为7.19%，分子量为1.813× 105 g/mol，主要成分为Man和Glu，其摩尔比为1∶1∶1。FT-IR、热分析和SEM观察证实了铁螯合作用，同时保留了多糖的基本结构。此外，体外模拟胃肠道消化揭示了LLP-Fe (III) 络合物的稳定性和耐受性。结果表明，LLP-Fe (III) 配合物在胃和肠中的铁释放率分别为19.6%和4.5%，表明LLP-Fe (III) 配合物是一种稳定、高效的铁-多糖结合物，具有进一步开发作为铁补充剂的潜力。

Synthesis and functional analysis of polysaccharide-Fe (III) complexes from Lilium davidii var. willmottiae: a step toward bioavailable iron supplements

Hong Jiang1, Xiaojun Li1,2,3, Ruili Jiang1,2, Yinquan Wang2, Fankui Zeng1*

1 Research Center for Natural Medicine and Chemical Metrology, Lanzhou Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences (CAS), Lanzhou, 730000, China

2 College of Pharmacy, Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou, 730000, China

3 Gansu Provincial Cancer Hospital, Lanzhou, 730050, China

*Corresponding author.

Abstract

Lilium polysaccharides (LLP) exhibited various biological activities. However, the low bioavailability of polysaccharides limits their effectiveness in practical applications. To enhance their functionality and bioavailability, polysaccharides from Lanzhou lily (Lilium davidii var. willmottiae (E.H. Wilson) Raffill) bulbs were purified and chemically synthesized into polysaccharide-Fe (III) complexes in this study. Then, the structural characterization, physicochemical properties, thermal stability and digestibility of LLP-Fe (III) were systematically evaluated to assess its potential as an iron supplement. Results showed that LLP-Fe (III) had a higher molecular weight than LLP, with a monosaccharide composition dominated by mannose and glucose at a molar ratio of 1:1.23. LLP-Fe (III) was also revealed to have significantly enhanced thermal stability. FT-IR analysis confirmed the chelation between Fe (III) and carboxyl and hydroxyl groups in LLP through stable Fe−OOH bonds. Scanning electron microscopy displayed a dense morphology with smooth and small particles in LLP-Fe (III). Furthermore, in vivo simulated digestion tests indicated superior gastrointestinal stability and acid tolerance of LLP-Fe (III). These findings suggested that the polysaccharide-Fe (III) complexes hold promise as a novel iron supplement with potential health benefits.

Reference:

Jiang, H., Li, X., Jiang, R. et al. Synthesis and functional analysis of polysaccharide-Fe (III) complexes from Lilium davidii var. willmottiae: a step toward bioavailable iron supplements. Agric. Prod. Process. Sto. 1, 26 (2025). https://doi.org/10.1007/s44462-025-00032-6

翻译：管勤昊（实习）

编辑：梁安琪；责任编辑：孙勇

封面图片来源：图虫创意

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