Nat Biotechnol丨王海峰/方显杨/颉伟合作团队利用新型CRISPR活细胞成像技术揭示染色质动态调控机制

三维基因组与表观遗传修饰共同调控基因表达，其动态变化与细胞分化、发育及多种疾病的发生密切相关。测序技术和固定细胞荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization, FISH）等方法推动了三维基因组互作研究，但主要依赖固定样本，难以捕捉染色质在活细胞中的实时动态过程。传统DNA活细胞成像技术通常需要在目标区域插入特定DNA序列，操作较为繁琐。而近年来发展的CRISPR成像技术虽能靶向内源基因，但受限于系统复杂、信号灵敏度不足等问题，在非重复序列标记、多位点同时成像及原代细胞应用中仍有很大难度。

2025年11月6日，清华大学生命科学学院王海峰实验室、颉伟实验室与中国科学院生物物理研究所方显杨实验室在Nature Biotechnology发表研究论文，题为CRISPR live-cell imaging reveals chromatin dynamics and enhancer interactions at multiple non-repetitive loci。研究团队在此前CRISPR LiveFISH技术基础上，创新性地结合拓展遗传字母表技术，开发出新型活细胞多色成像技术——CRISPR PRO-LiveFISH（Pooled gRNAs with Orthogonal bases LiveFISH），适用于非重复DNA序列在活细胞内的高灵敏度、多通道实时成像，并利用这一技术研究了染色质动态与表观修饰、增强子互作之间的相互关系。

前期开发的CRISPR LiveFISH技术，通过体外组装dCas9与荧光引导RNA（guide RNA, gRNA），再递送至细胞，可以实现活细胞多色DNA成像，已应用于在活细胞内追踪基因编辑、染色体易位和RNA转录等生物学过程。CRISPR LiveFISH技术提供了一个“即配即用”的试剂型平台，可用于多种细胞类型的活细胞成像。

在此基础上，研究团队进一步开发了CRISPR PRO-LiveFISH技术, 适用于非重复DNA序列的活细胞标记。团队引入“拓展遗传字母表”中的正交非天然碱基对（unnatural base pairs,UBPs），结合Cas9/sgRNA结构指导的理性设计，可以通过体外转录与转录后修饰，从DNA库高通量制备高质量的荧光sgRNA探针库。PRO-LiveFISH可同时对多达6个不同基因位点进行多色观测，且仅需约10条sgRNA即可高效标记非重复位点，可实现高灵敏度、低背景的活细胞成像。

图1：CRISPR PRO-LiveFISH 的设计策略及应用

基于PRO-LiveFISH活细胞成像技术，研究团队探索了染色质动态与表观修饰和基因表达调控之间的关系：

染色质的表观修饰与基因调控和细胞命运决定密切相关，但其如何直接影响特定染色质区域的时空动态仍不明晰。研究团队探索了表观遗传和基因位点动态的相关性。通过小分子药物调控组蛋白乙酰化水平，显示当乙酰化水平下降时，基因位点运动活性增强，而乙酰化提高时，位点运动则呈现出相对受限的动态。这一结果表明，特定基因位点的时空动态与其表观修饰状态密切关联。在不同类型的分化细胞中，对同一位点进行活细胞标记，具有不同表观修饰水平的细胞也显示了类似的动态变化趋势。这一结果显示在分化过程中表观修饰水平的变化可能影响特定基因位点的时空动态。

增强子与启动子的时空互作与基因转录调控密切相关，但其动态特性与功能关联仍存在未解之处。例如，它们的空间互作是瞬时还是持久的？是直接还是间接的？研究团队探索了特定基因位点与增强子互作的时空动态，利用多位点动态标记观察到特定基因与其增强子在活细胞内存在相对稳定的空间邻近， 说明这一增强子–启动子互作具备相对的时空稳定性，为其在活细胞内的动态特性提供了直接的成像证据。

超级增强子可以调控很多关键基因（如癌基因）的激活，其中共激活因子BRD4在其中发挥了有重要作用。利用PRO-LiveFISH成像技术，研究团队发现在使用BRD4抑制剂处理肿瘤细胞后，特定癌基因与其超级增强子之间的距离显著增加，伴随着基因表达的下调。这一结果表明BRD4在维持超级增强子与靶基因的三维互作中发挥重要作用，为理解其在癌基因激活中的作用机理提供了动态视角。

综上，CRISPR PRO-LiveFISH技术将“拓展遗传字母表”与Cas9/sgRNA的理性设计结合，为研究三维基因组的动态变化提供了高效、灵活的新型活细胞成像工具。该工具能实现对非重复DNA序列进行多色实时标记，也适用于原代细胞。基于这一平台，研究团队探索了染色质的动态变化与其表观修饰之间的关联。同时，揭示了特定基因的增强子–启动子互作的时空特性，并阐释了转录共激活因子BRD4对于维持超级增强子空间互作的关键作用，这些工作为理解基因调控的时空动态机制提供了新的视角。

清华大学生命科学学院王海峰研究员、颉伟教授以及中科院生物物理所方显杨研究员是本文的共同通讯作者。清华大学博士生刘美铄、黄可韵和张杰（已毕业）为共同第一作者。西湖大学于洪涛教授、戚树涛研究员，清华大学博士后杜振海（现中科院分子细胞科学卓越创新中心研究员），以及清华大学博士生李青阳、王新铭、顾卜铭、唐昊、马宇、胡梁俊（已毕业）等对研究做出重要贡献。

https://doi.org/10.1038/s41587-025-02887-3

制版人： 十一

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