Nat Chem Biol丨王杰/陈鹏合作开发基于“生死选择”的蛋白酶进化技术用于蛋白质的靶向编辑

蛋白酶通过切割酶原或前体蛋白生成新的生物活性分子，参与调控多种生理与病理过程，包括程序性细胞死亡、血液凝固级联反应以及病原体感染等。重编程蛋白酶底物特异性，有望实现对目标蛋白的选择性降解、特定信号通路的按需激活，甚至病理性蛋白的精准清除，从而衍生一系列在基础研究与疾病干预中的革命性应用。

对标基因编辑工具对核酸序列进行靶向切割（或改写），若能以类似的“可编程”理念重塑蛋白酶的底物特异性，使其识别并切割新的目标蛋白，将为蛋白质层面的精准编辑开辟全新路径。基因编辑需要识别15-18个碱基长度的核酸序列才可以在基因组上实现特异性不同，蛋白酶仅需要识别5-7个氨基酸长度的多肽序列就可以在蛋白组上实现特异性，而一个蛋白酶的口袋大小，通常在4-8个氨基酸范围，因此，通过高效的定向进化方法，改变蛋白酶的底物特异性，有望实现蛋白质的靶向编辑。

2025年10月31日，针对上述蛋白酶重编程面临的机遇和挑战，南方科技大学王杰课题组和北京大学陈鹏课题组合作在NatureChemical Biology期刊上发表了文章A gasdermin-based life–death evolutionsystem for reprogramming protease specificity，将蛋白酶的化与宿主的增殖实现关联，构建了一种基于“生死选择”的高通量定向进化系统。并进一步通过该系统进化TEV蛋白酶，使其能识别并切割多种细胞靶蛋白。

天然蛋白酶的序列多样性有限，难以满足大规模、精确的蛋白质编辑需求。要实现这一目标，必须对天然酶的底物特异性进行系统性重编程。然而，要让一种蛋白酶“改刀换刃”并非易事。蛋白酶识别底物的方式极为精细：它们依赖4–8个连续氨基酸残基在空间和化学上的精确匹配，以定位切割位点。哪怕微小的识别序列改变，也可能扰动酶的整体构象或催化中心，导致活性丧失。传统的定向进化方法虽然可以通过突变和筛选获得部分改良的酶，但受限于通量和成本，难以在庞大的突变空间中快速筛选出理想变体，实现对不同序列的高特异性切割。这使得蛋白酶的特异性改造长期停留在“微调”阶段，而难以实现真正意义上的重编程。

为了实现对蛋白酶底物特异性的重塑，研究团队利用细胞焦亡的功能执行蛋白-Gasdermin D（GSDMD），构建了一种基于“生死选择”策略的蛋白酶定向进化平台。

首先，他们发现在原核生物中表达GSDMD的N端结构域（1-275，GD-N）可以对大肠杆菌的膜结构产生破坏，从而对其生长产生明显的抑制。不仅如此，大肠杆菌的生长速度可以很好的受到GD-N的表达水平的调控，呈现出剂量依赖的效果，从而验证GD-N是一个很好的筛选标签。

随后，他们在GD-N蛋白表面的loop区（R153-V163）插入了TEV蛋白酶的目标序列，通过筛选发现这一序列的引入不影响GD-N蛋白对大肠杆菌生长的抑制，进而实现对蛋白酶突变体的筛选：当蛋白酶突变体能识别并切割目标序列，毒蛋白GD-N的活性被破坏，细胞存活；当蛋白酶突变体不能识别目标序列，GD-N蛋白对细菌膜结构破坏，细菌生长受到抑制。

通过连续的培养，含有高活性突变体的大肠杆菌，生长速度较快，从而被富集，构建好的蛋白酶定向进化平台可一轮筛选中，对高活性突变体可以实现百万倍的富集效果。

研究团队利用所建立的定向进化平台，对TEV蛋白酶进行了系统进化，使其能够特异性识别并切割来源多样、结构复杂的内源性底物，包括膜蛋白CD22、线粒体蛋白ALAS1以及核蛋白EZHIP。其中CD22是一种B细胞特异性膜受体，通过抑制BCR信号维持免疫稳态，同时是B细胞相关肿瘤的重要治疗靶点。ALAS1是血红素生物合成途径中的关键限速酶，其异常激活是Ⅰ型卟啉病的主要致病因素。EZHIP是一种位于细胞核的调控蛋白，通过抑制PRC2活性重塑H3K27甲基化图谱，在维持发育可塑性及中枢神经系统肿瘤发生中发挥关键作用；其异常高表达可导致表观遗传失衡并促发弥漫性中线胶质瘤。

对于CD22靶点，研究者选取了其靠近细胞膜结构域的一段序列，该序列与TEV原始识别序列相比，在7个氨基酸中有5处发生了改变（ENLYFQS vs. EPVKVQH）。基于对底物不同氨基酸位点对特异性贡献的分析，以及识别口袋中关键残基在底物结合中的作用，团队设计了TEV蛋白酶的进化路径，并构建了满足多轮进化需求的饱和点突变文库，最终获得了能够高效切割目标序列的酶切活性突变体。

对于ALAS1靶点，研究者选取了HNIYVQA（551-557）作为目标序列, 研究团队通过定向进化获得了能够特异性识别并切割ALAS1特定氨基酸序列的TEV蛋白酶突变体。在体外和体内实验中，该突变体均表现出良好的序列正交性，未观察到明显脱靶效应。

对于EZHIP靶点，研究者选取了ERLAFQS（377-383）作为目标序列，研究团利用GSDMD进化平台，仅一轮进化便获得了能够特异性酶切EZHIP的TEV突变体。该突变体在体外对EZHIP表现出明显的切割活性；将其递送至U2OS细胞后，能有效降低内源性EZHIP蛋白水平，同时显著提高组蛋白H3K27Me3水平。

图1：蛋白酶的特异性进化与蛋白质的靶向编辑

总之，这项工作建立的GSDMD定向进化平台能够高效重编程蛋白酶底物特异性，实现对多种内源性蛋白的精准切割。该平台可在单轮筛选中实现百万倍富集，显著提高筛选效率；结合饱和点突变库和底物-逐步策略，能够覆盖超过10⁹级别的蛋白酶突变体，充分探索突变空间。利用该平台成功进化TEV蛋白酶切割膜蛋白CD22、线粒体蛋白ALAS1及核蛋白EZHIP，验证了其在不同亚细胞环境下的普适性与可编程性。此外，该平台可与多种蛋白递送系统结合，实现内源性蛋白在活细胞中的定点切割，为蛋白质组水平的精确编辑提供强有力工具，同时为治疗、诊断及功能研究应用奠定了基础。

南方科技大学王杰教授和北京大学陈鹏教授为本文的共同通讯作者，南方科技大学博士后高子奇、李天真和研究生叶昊为本文的共同第一作者。

https://www.nature.com/articles/s41589-025-02063-3

制版人： 十一

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