《食品科学》：西华大学邢亚阁教授等：青柠檬腐败真菌分离鉴定及UV结合LED光诱导复合膜液对其抑菌效果

青柠檬（

Citrus aurantium

）是芸香科柑橘属小乔木，别名西柠檬、洋柠檬、益母果等，凭借独特风味和丰富营养成为广受青睐的食用水果。青柠檬因多汁且组织脆弱，在采后运输及贮藏中极易产生机械损伤，导致病原菌通过伤口侵染，引发果肉转黄、软化凹陷及霉菌滋生，直至整颗果实全部腐烂变质，散发出刺鼻的霉味。

真菌病害是造成柑橘类果实在贮藏和运输期间腐烂的最主要原因，包括意大利青霉（

Penicillium italicum

）引起的青霉病、指状青霉（

P

digitatum

）引起的绿霉病、柑橘链格孢（

Alternaria citrus

）引起的黑腐病、胶孢炭疽菌（

Collectotrichum gloeosporioides

）引起的炭疽病。其中，青霉和绿霉病在真菌病害中尤为严重，也是青柠檬等柑橘类水果研究的痛点、难点和热点。

近年来，可食性涂膜因其具有环境友好、安全性高的优势，成为食品保鲜领域的研究热点。壳聚糖（CTS）是一种天然阳离子碱性多糖，具有抑菌、抗氧化、可食用等特性，常被选为可食性涂膜的制备基材。然而，纯CTS涂膜存在不均匀、抗菌能力一般等缺点，需与其他物质联合使用，以改善涂膜表面粗糙度、增强抑菌效果。纳米TiO2作为光催化材料，具有良好的热稳定性且无毒，其抑菌机理是通过光催化作用，在紫外或可见光诱导下生成活性氧簇，破坏菌体细胞膜，导致细胞内容物外渗，出现菌体空壳现象。纳米Ag粒径约25 nm，能大面积接触病原菌，且在可见光诱导下可被激发，其抑菌机理是利用其强烈穿透力，破坏细胞DNA结构，改变细胞壁和细胞膜的透过性，使菌体细胞代谢和繁殖功能受阻直至死亡。研究表明，纳米TiO2与纳米Ag可弥补纯CTS涂膜的不足，且具有协同抗菌效果，将三者制成复合膜液可增强抑菌效果。此外，光催化纳米TiO2能增强其抗菌能力，而纳米Ag的添加则通过提高光吸收率、增加表面活性位点，进而扩大TiO2的光催化面积，提升其光催化性能。

西华大学食品与生物工程学院的杨路林、范湘凤、邢亚阁*等研究以腐败青柠檬果皮为分离源，分离并纯化得到青柠檬病原真菌。随后，通过形态学观察和分子生物学鉴定等手段，明确引起青柠檬采后腐败的真菌种类。在此基础上，进一步利用紫外光结合发光二极管（ LED ）光诱导 CTS-TiO2-Ag 纳米复合膜液对分离得到的腐败真菌进行抑菌实验，研究其对青柠檬采后腐败真菌的抑制作用，包括对抑菌圈、霉菌生长、菌丝干质量、胞外电导率、蛋白质和核酸外渗等多个指标的影响，以期为青柠檬的保鲜和防腐提供一种高效、环保的新方法，同时也为光诱导抗菌技术的应用提供理论依据和实践参考。

1 青柠檬致腐真菌的分离纯化、回接验证及致病性分析

取自然腐败的青柠檬，采用平板划线法培养分离纯化得到的3 株形态学不同的致病菌，以F1、F2和F3进行编号区分，如图1所示。将分离纯化得到的3 株形态学不同的真菌F1、F2和F3采用有伤接种法分别回接到完好的青柠檬上的不同部位，以形成实验（a、b、c）和对照部位（d），并将其置于保鲜盒中，放置10 d后对其进行观察。结果表明，对青柠檬存在较强致病作用的病原菌为F1和F3，相比较而言，F2致病作用较弱。由图2可知，青柠檬的实验部位（F1a～F1c、F2a～F2c、F3a～F3c）明显变黄，变软，凹陷，且随时间延长，病斑直径不断生长扩大，且有强烈的腐败气味、霉味，表面出现菌体生长，直至整个青柠檬腐败。但是对照部位（F1d、F2d、F3d）的颜色、质地等在相同时间内无明显变化。另外，在相同时间条件下，回接F1和F3菌株的青柠檬变黄变软的速度快于回接F2菌株的青柠檬，即F1和F3对青柠檬的致腐性强于F2。将回接后再分离得到菌株与自然腐烂分离得到的菌株形态进行对比，结果一致，根据科赫法则原理，可以确定分离出的菌株能够使青柠檬腐败。所以认为F1、F2和F3是导致采后青柠檬腐败的重要致腐菌。

2 青柠檬病原真菌的形态特征观察及镜检

对分离纯化后得到的菌株进行形态学观察，分离所得3 株主要腐败菌PDA菌落形态如图3所示，致腐真菌F1呈圆形，边缘整齐，质地疏松，外观干燥，颜色正面暗黄绿色后变橄榄灰，反面为乳黄色，呈绒状；致腐真菌F2呈圆形，边缘整齐，质地疏松，外观干燥，颜色正面菊蓝色，反面为橘红色，呈密毡状；致腐真菌F3呈圆形，边缘整齐，质地疏松，外观干燥，颜色正面淡灰绿色，反面为乳黄色，呈绒状。

对分离纯化后得到的菌株进行镜检观察，分离所得3 株腐败菌镜检结果如图4所示，致病菌F1菌丝有横隔，分生孢子梗短，帚状枝大而不规则，分生孢子卵形至圆柱形；致病菌F2菌丝有横隔，菌丝细长，分生孢子呈球形；致病菌F3菌丝有横隔，分生孢子梗集结成束，帚状分支3 层，分生孢子圆筒形至椭圆形或近球形。结合图3青柠檬病原真菌的形态特征观察结果，初步判断菌株F1、F2和F3均为真菌，且为青霉属。

3 青柠檬致腐真菌ITS区PCR扩增产物凝胶电泳成像

图5展示了F1、F2和F3 3 株病原菌的PCR扩增结果，3 条较明显的序列DNA条带分别对应F1、F2、F3，且DNA序列大小在500～750 bp之间，这与真菌的ITS序列片段长度一般在500～750 bp吻合，说明3 株致腐菌的ITS序列均被成功扩增，同时可以初步判断3 株致腐菌均为真菌，这与菌株形态特征观察结果一致。

4 BLAST序列比对及系统发育树的构建

利用ContigExpress软件对获得的序列进行拼接和测序结果的处理，确保序列的准确性和完整性。在拼接过程中，去除序列首尾两端可能存在的不准确部分。将拼接好的序列提交至NCBI数据库进行比对分析，得出与菌株F1、F2和F3序列相似度最高的菌株分别为P. digitatum、P. jacksonii、P. italicum，且相似度均达99%以上。利用MEGA 11.0软件构建了青柠檬病原菌的系统发育树，如图6所示，菌株F1与指状青霉（P. digitatum）存在较近的亲缘关系；菌株F2则与杰克逊青霉（P. jacksonii）关系紧密；而菌株F3则与意大利青霉（P. italicum）有着较近的亲缘性。进一步地，在NCBI数据库中对这3 株菌的基因序列进行了BLAST同源性对比，结果显示与其近缘菌株的相似度均高达99%以上，其中最高相似度甚至达到了100%。

5 UV结合LED光诱导复合膜液对霉菌抑菌圈的影响

在抑菌圈实验中，当抑菌环宽度大于1 mm时，可被认为具有良好的抑菌活性。由表1～3可知，处理组相较于对照组都具有一定的抑菌性；随着光诱导时间的延长，抑菌圈直径总体呈增大的趋势。当光诱导时间相同且为90 min时，对F1～F3菌具有最好效果的光处理分别为紫外结合LED灯红光、紫外结合LED灯绿光和紫外结合LED灯红光，抑菌圈直径分别为（8.38±0.12）、（9.62±0.05）mm和（10.49±0.24）mm，分别是对照组的1.63、2.02 倍和2.31 倍；与光诱导30 min处理组相比，分别是其1.31、1.15 倍和1.63 倍。由此可得，对F1和F3菌而言，抑菌效果较优的光处理和光诱导时间均为紫外结合LED灯红光诱导90 min，抑菌圈直径分别为（8.38±0.12）、（10.49±0.24）mm；对F2菌而言，抑菌效果较好的光源及光诱导时间为紫外结合LED灯绿光60 min，其抑菌圈直径为（9.69±0.17）mm。

6 UV结合LED光诱导复合膜液对霉菌菌丝干质量的影响

菌丝干质量是抗霉菌研究中衡量抑菌效果的关键指标之一，可以从数值的大小直观反映霉菌菌丝的生长情况。这一指标不仅反映了霉菌的生长活力，更是评估抑菌效果的重要依据。菌丝作为霉菌的主要生长形态，其干质量的大小直接关联到霉菌的生命活动和新陈代谢，通过对比不同条件下霉菌的菌丝干质量，可以直观地了解抑菌剂对霉菌生长的抑制程度。图7展现了不同光源及光照时间诱导复合膜液对F1～F3霉菌菌丝干质量的影响。总体而言，相同光照时间、不同结合光诱导组菌丝干质量均小于对照组，随着诱导时间的延长，3 种致腐菌菌丝干质量均不断减少，且不同诱导光源之间具有显著性差异（

P

＜ 0.05 ），表明结合光较单一紫外诱导抑菌效果好。当光诱导时间相同且均为 90 min 时，对 F1 ～ F3 菌株产生很好抑制效果的诱导光源为紫外结合 LED 灯红光、紫外结合 LED 灯红蓝光和紫外结合 LED 灯绿光，菌丝干质量分别为 9.53 、 11.63 、 9.57 mg ，较对照组分别减少了 48.20% 、 42.79% 、 57.46% ，较光诱导 30 min 处理组分别减少了 48.29% 、 42.90% 、 32.74% 。由此可得，紫外结合不同 LED 灯光可以诱导 CTS-TiO2-Ag 复合膜液对青柠檬致腐菌菌丝干质量产生显著影响，并且在 90 min 处理时间时的影响相对最大；对 F1 ～ F3 菌而言，较优的光处理分别为紫外结合 LED 灯红光、紫外结合 LED 灯红蓝光和紫外结合 LED 灯绿光，效果较好的光诱导时间均为 90 min 。

7 UV结合LED光诱导复合膜液对霉菌菌丝生长抑制率的影响

菌丝生长抑制率是一个在抗真菌效果评估中至关重要的指标，不仅能够体现抗真菌药物或处理方法的抗菌效力，还能从侧面反映出菌体细胞被破坏的情况。菌丝生长抑制率的高低直接反映了抗真菌药物或处理方法的效力，较高的生长抑制率意味着抗菌剂或处理方法对霉菌的生长具有较好的抑制作用，能够有效地破坏菌体细胞的结构和功能。抑菌效果越好，则霉菌生长受到抑制，即菌丝生长抑制率越大。由图8可知，与对照组相比，不同光诱导复合膜液对3 种致腐青霉菌均有抑制效果，并受红光照射影响最大。随着处理的时间延长，指状青霉（F1）和杰克逊青霉（F2）菌丝生长抑制率上升趋势显著，意大利青霉（F3）菌丝生长抑制率有略微上升。经紫外结合LED灯红光诱导90 min处理后，F1～F3菌丝生长抑制率分别为90.57%、60.21%、56.06%，均高于经30 min时间处理后的菌丝生长抑制率（67.43%、41.07%、47.25%）。由此可得，当光诱导时间相同时，对3 种青柠檬致腐微生物影响较好的处理光源为紫外结合LED红光处理组；当诱导光源相同时，F1～F3菌株的菌丝生长抑制率与诱导时间呈正相关；对青柠檬分离纯化得到的3 种致病菌较优抑菌处理条件均为紫外结合LED红光诱导90 min。

8 UV结合LED光诱导复合膜液对霉菌胞外电导率的影响

真菌膜对于维持细胞正常功能起着至关重要的作用，许多研究发现各种抗真菌药物直接或间接靶向细胞膜或其成分，其目的是破坏膜结构，通过特异性作用于质膜杀死真菌。胞外电导率是衡量抗真菌效果的重要指标，它的值与细胞膜通透性密切相关，胞外电导率越大，则表示菌体细胞膜被破坏得越严重。不同光源及光照时间诱导复合膜液对F1～F3 3 种霉菌的细胞膜通透性的影响如图9所示。3 种青柠檬致病菌在相同时间下结合光诱导组胞外电导率较对照组均有所增加，在90 min处理时间时电导率大于30、60 min处理组。F1～F3菌株依次在紫外＋红绿蓝结合光、紫外＋绿光、紫外＋红光处理90 min时电导率增加最大，分别为8.49、8.27、8.30 mS/cm，较对照组分别增加了34.55%、31.90%、25.95%，较结合光诱导30 min处理组（6.64、7.88、7.96 mS/cm）分别增加了27.86%、4.95%、4.27%。由此推测，结合光诱导组引起电导率增大可能是由于在光催化条件下，CTS及其复合膜液对细胞膜具有更强的破坏作用，可能导致细胞膜完整性受损，甚至加剧破坏程度，这种破坏作用使得菌体细胞内的物质更容易渗出，进而造成电导率的上升。结果表明，不同结合光诱导对青柠檬致病菌的影响不尽相同，但抑真菌效果随着诱导时间的延长而增强，且均在诱导时间为90 min时效果较优，表明此时菌体细胞细胞膜受到损伤较为严重，胞内物质大量外渗。

9 UV结合LED光诱导复合膜液对霉菌细胞蛋白质外渗的影响

细胞膜不但是真菌必不可少的组成部分，也是大部分抗菌物质作用的靶点，其在微生物生命活动中的作用十分重要，而细胞内容物的泄漏可反映出细胞膜受到严重且不可逆的损伤。当菌体细胞膜受到破坏时，原本位于细胞内部的蛋白质可能会泄漏到细胞外部。蛋白质作为生命活动的重要基础，其分子结构中含有多种氨基酸，如酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸等，这些氨基酸中的苯环结构在紫外280 nm波长处有最大吸收峰，其吸收值与蛋白质浓度呈正比，且该值与菌体细胞膜被破坏的程度也呈正比。由图10可以看出，F1～F3菌株不同结合光诱导组在相同光照时间下较对照组OD280值显著增大（

P

＜ 0.05 ）。综合来看，当光诱导时间相同且为 90 min 时，对 3 种青柠檬致腐菌株产生很好抑制效果的诱导光源均为紫外＋红光，其蛋白质溶出值（ 1.16 、 1.63 、 1.53 ）与对照组相比（ 0.83 、 0.87 、 1.03 ），分别增加 39.76% 、 87.36% 、 48.54% ，与 30 min 光诱导处理组（ 0.87 、 1.28 、 1.28 ）相比，分别增加 33.33% 、 27.34% 、 19.53% 。由此可得，紫外结合不同 LED 灯光可以够诱导 CTS-TiO2-Ag 复合膜液对青柠檬致腐菌细胞膜产生显著影响；对 F1 ～ F3 菌而言，较好的光处理为紫外结合 LED 灯红光，效果较好的光诱导时间均为 90 min 。

10 UV结合LED光诱导复合膜液对霉菌细胞核酸外渗的影响

核酸作为生命体中至关重要的遗传物质，其结构特点之一是含有嘌呤和嘧啶这两大类碱基。这些碱基是核酸分子中的关键组成部分，负责存储和传递遗传信息。这些碱基的共同特征之一是它们都含有共轭双键（—C＝C—C＝C—），这种特殊的化学结构使得核酸分子在紫外光区展现出独特的光学性质。具体来说，当核酸分子受到波长在250～280 nm范围的紫外光照射时，这些共轭双键会强烈吸收光能。其中，最大吸收值通常出现在260 nm左右，其吸收值与核酸浓度呈正比，且该值与菌体细胞膜被破坏的程度也呈正比，常用该值反映菌体细胞核酸类物质外渗情况。从图11可以看出，在相同光照条件下，3 种致腐菌的OD260值随时间延长均呈明显上升趋势（

P

＜ 0.05 ），在相同时间内，紫外结合红光照射下 3 种致腐菌的 OD280 值最大，在 90 min 的光照时间下，其核酸外渗值（ 1.14 、 1.46 、 1.45 ）与对照组（ 0.86 、 0.99 、 1.00 ）相比，分别增加 32.56% 、 47.47% 、 45.00% ，与 30 min 处理组（ 0.95 、 0.97 、 1.03 ）相比分别增加 20.00% 、 50.52% 、 40.78% 。结果表明在紫外＋红光结合光照下 CTS-TiO2-Ag 复合膜液处理可导致柠檬致腐菌核酸类物质外渗，并且随着时间延长外渗量呈增加趋势，光照 90 min 时，核酸类物质外渗量较大。

结 论

本研究通过对腐烂青柠檬上的腐败真菌进行纯化分离，最终分离出3 株菌株，将这3 株菌株根据科赫法则在新鲜青柠檬反接种时皆出现明显的腐坏症状，通过回接到新鲜青柠檬上验证3 种菌株的致病性，从系统发育树得到的近源菌株与分离菌株的形态学特征基本一致，最终确定菌株F1是指状青霉（P. digitatum），F2是杰克逊青霉（P. jacksonii），F3是意大利青霉（P. italicum）。

在明确青柠檬致腐真菌后，探究了紫外结合LED灯诱导CTS-TiO2-Ag纳米复合膜液对P. digitatum、P. jacksonii和P. italicum的抑菌效果。结果表明，当诱导光源相同时，随着光诱导时间的延长，其抑菌评价指标呈现向好的趋势；总体而言，紫外结合LED灯光诱导效果优于纯紫外诱导；当光诱导时间相同时，UV结合LED红光处理效果最佳。CTS作为载体，可增强TiO2和Ag的分散性和稳定性，同时三者具有协同抗菌作用，加上光诱导生成多种具有强氧化性的活性基团，如羟自由基和超氧阴离子自由基，破坏菌体细胞细胞壁膜，使得内容物外渗，体现在胞外电导率、核酸和蛋白质外渗值增加；另外，穿透细胞壁后，作用于菌体内蛋白质，抑制其合成，改变其结构，从而影响菌体的正常生长和能量传输过程，菌体被抑制，体现在抑菌圈增加、菌丝干质量下降、菌丝生长抑制率上升。结果表明，此抑菌方式抗真菌过程中涉及了多种组分的协同作用，这种复合材料通过破坏菌体细胞的结构和功能，可有效地抑制和杀灭真菌。

作者简介

通信作者：

邢亚阁教授

西华大学食品与生物工程学院

博士、教授、硕士生导师，成都市第十八届人大代表，九三学社成都市委委员、九三学社西华大学主委。第十二批四川省学术和技术带头人后备人选，科技部三区服务专家，西华大学首批“青年学者”，首批十名唐立新优秀学者之一，2015.11-2016.11加拿大圭尔夫大学访问学者。研究方向为农产品贮藏保鲜与精深加工技术。第一作者和通讯作者发表SC1收录英文文章70余篇，参编英文著作1部，主持编著《食品工业技术经济学》教材1部，申请国家发明专利60余项。主持参与国家级、省部级、市级和企业委托项目40余项。获四川省科技进步二等奖1 项、天津市科技进步二等奖2 项，四川省科技进步三等奖2 项，完成省级鉴定成果或评价10余项。

工作经历

2003.7-2005.2，郑州三全食品股份有限公司工作;2005.3-2006.7 郑州鑫泉水处理工程有限公司工作;

2011.7-至今，西华大学食品与生物工程学院工作

2015.11-2016.11，加拿大丰尔夫大学访问学者

教育经历

2006.9-2011.6，天津科技大学农产品加工及贮藏工程专业硕博连读，攻读硕士、博士学位。

2000.9-2003.7，信阳农林学院(原信阳农专)，食品工艺专业大专。

研究方向

农产品贮藏保鲜技术

农产品非热精深加工技术

川菜工业化与新型泡菜生产技术

第一作者：

杨路林 研究生在读

西华大学食品与生物工程学院

本文《 青柠檬腐败真菌分离鉴定及UV结合LED光诱导复合膜液对其抑菌效果》来源于《食品科学》2025年46卷第17期142 -152 页，作者：杨路林, 范湘凤, 邢亚阁 * , 何 丽，但 利，雷春晓，田 园 。DOI: 10.7506/spkx1002-6630-20250318-134. http://www.spkx.net.cn 点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑：申婧婧；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。