天津大学刘文广团队Cell Biomater：茶多酚调控二级结构构建高强度高韧性天然蛋白质水凝胶作为骨引导再生膜

摘要

骨引导再生（GBR）膜迫切需要具有理想强度 - 韧性平衡的天然蛋白质基水凝胶。本文提出了一种茶多酚（TP）调控二级结构的强化策略，将茶多酚作为 “力学调节剂” 来调控蛋白质的二级结构，进而制备高强度、高韧性的天然蛋白质基水凝胶。经茶多酚处理的天然蛋白质基水凝胶展现出优异的力学性能，其拉伸强度高达（2.64±0.20）MPa、杨氏模量为（60.37±2.71）MPa、韧性达（1.83±0.13）MJ/m³，性能超过了大多数纯天然蛋白质基水凝胶。该策略还能制备出具有不对称多孔结构的天然蛋白质基水凝胶膜，该膜不仅力学性能优良，还具备抗氧化、抗菌和促成骨等作用，可作为物理屏障阻止软组织侵入，同时促进骨组织再生。体内实验结果表明，该水凝胶膜在促进牙周骨再生方面效果显著，证实了其作为骨引导再生膜的潜力。

1. 引言

骨引导再生（GBR）膜在治疗牙周骨缺损中至关重要，它需要具备不对称结构，朝向软组织的一侧结构致密以阻止软组织侵入，朝向骨缺损的一侧呈多孔状以支持骨组织再生。目前常用的胶原基膜（如 Bio-Gide）虽有良好生物相容性，但存在降解速度快、力学性能不足的问题，易引发膜迁移等情况。天然蛋白质是制备骨引导再生膜的理想材料，然而多数天然蛋白质水凝胶因分子排列无序且亲水性强，力学性能较差。受自然界中富含 β- 折叠结构的高强度材料（如蚕丝）启发，研究人员尝试提高蛋白质中 β- 折叠结构含量，但 β- 折叠结构过多会导致材料变脆。茶多酚（TPs）能与蛋白质结合并改变其构象，有望通过促进 β- 折叠结构形成以提升强度，同时充当物理交联剂防止过度聚集以保证韧性，从而平衡材料的强度与韧性。本研究利用茶多酚调控蚕丝蛋白（SF）和牛血清白蛋白（BSA）的二级结构，制备高强度、高韧性水凝胶，进而制成用于骨引导再生的不对称多孔（AP）膜。

2. 结果与讨论 2.1 SFMA/BSAMA/TP 水凝胶的制备与力学性能

以甲基丙烯酸酯化的蚕丝蛋白（SFMA）和甲基丙烯酸酯化的牛血清白蛋白（BSAMA）为原料，经共聚反应制备 SFMA/BSAMA 水凝胶，再将其浸泡在茶多酚溶液中，以茶多酚为力学调节剂制得 SFMA/BSAMA/TP 水凝胶（简称 SxByT 水凝胶）。纯 SFMA（Sx）水凝胶和纯 BSAMA（By）水凝胶质地较脆，而经茶多酚处理后的水凝胶（SxT、ByT）力学性能得到改善。其中，SxT 水凝胶质地柔软且具延展性，B20T 水凝胶强度较高但脆性较大。SxByT 水凝胶结合了两者优势：S10B20T 水凝胶的拉伸强度（2.64±0.20）MPa 和杨氏模量（60.37±2.71）MPa 最高；S20B10T 水凝胶的韧性（1.83±0.13）MJ/m³ 最佳。茶多酚处理的最佳条件为浓度 10%（质量分数）、浸泡时间 20h，且 S20B10T 水凝胶还具备良好的弹性恢复能力和能量耗散能力。

2.2 SFMA/BSAMA/TP 水凝胶的结构表征

傅里叶变换红外光谱（FTIR）证实茶多酚成功融入水凝胶，且经茶多酚处理的水凝胶中 β- 折叠结构含量增加。圆二色谱（CD）分析显示，茶多酚处理使 SFMA 的二级结构从 α- 螺旋向 β- 折叠转变，同时增加了 BSAMA 中 β- 折叠结构的含量。小角 X 射线散射（SAXS）和原子力显微镜（AFM）研究发现，茶多酚在 S20B10T 水凝胶中诱导形成微相分离结构（未形成高度结晶），且相分离域尺寸（22.5nm）大于 S20B10 水凝胶（10.5nm），该微相分离结构起到增强作用。其作用机制为：茶多酚通过氢键和疏水作用与 SFMA/BSAMA 结合，诱导 β- 折叠结构形成；呈球状结构的 BSAMA 形成 β- 折叠结构后变得坚硬，呈无规卷曲结构的 SFMA 与茶多酚形成物理交联，可防止 β- 折叠结构过度聚集，从而使水凝胶强度和韧性达到平衡。

2.3 茶多酚与蚕丝蛋白分子模拟

通过分子动力学和分子对接模拟研究茶多酚与蚕丝蛋白（SF）的相互作用。茶多酚的主要成分（表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、表没食子儿茶素（EGC）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）、表儿茶素（EC））能与蚕丝蛋白形成稳定的 SF-TP 复合物，表现出稳定的均方根偏差（RMSD）、回转半径（Rg）和溶剂可及表面积（SASA）。氢键是两者间的主要相互作用，其中 EGCG 与蚕丝蛋白形成的氢键数量最多（约 9.33 个）。茶多酚通过氢键和疏水作用与蚕丝蛋白的亲水性残基结合，使蚕丝蛋白结构更紧密，进而增加 β- 折叠结构含量。

2.4 不对称多孔 SFMA/BSAMA/TP 水凝胶的制备与表征

采用粒子沥滤法制备不对称多孔（AP）水凝胶：将碳酸钙（CaCO₃）与 SFMA/BSAMA 混合，经重力沉降、光聚合、酸蚀刻（蚀刻 1h 以保留 Ca²⁺，发挥促成骨作用），最后进行茶多酚处理。制得的 AP S20B10T 水凝胶具有致密的顶部（朝向软组织一侧，起屏障作用）和多孔的底部（朝向骨组织一侧，起支架作用）。X 射线光电子能谱（XPS）和 X 射线衍射（XRD）分析证实，酸蚀刻使 CaCO₃分解，且水凝胶中保留了 Ca²⁺。水接触角（WCA）测试显示，水凝胶底部（34.7°±1.7°）比顶部（50.0°±3.0°）更具亲水性，且不对称多孔水凝胶仍保持良好的力学性能，适合用于骨引导再生。

2.5 不对称多孔 SFMA/BSAMA/TP 水凝胶的体外稳定性、酶降解性和生物相容性

AP S20B10T 水凝胶在体外具有良好稳定性，在生理盐水和人工唾液中质量变化微小，且在蛋白酶 K 作用下降解缓慢，与骨再生过程相匹配。该水凝胶具有良好的细胞相容性（大鼠骨髓间充质干细胞（rBMSC）存活率超过 95%）和血液相容性（溶血率为 3.41%±0.30%，低于 5% 的安全标准），还能促进大鼠骨髓间充质干细胞迁移，36h 时迁移率达 99.38%±0.08%，优于 S20B10 水凝胶组和对照组。

2.6 不对称多孔 SFMA/BSAMA/TP 水凝胶的体外抗氧化和抗菌性能

茶多酚从 AP S20B10T 水凝胶中释放时，前 24h 释放较快，之后释放速度放缓。该水凝胶具有优异的抗氧化性能，当茶多酚浓度为 0.2mg/mL 时，对 1,1 - 二苯基 - 2 - 三硝基苯肼（DPPH）自由基、2,2'- 联氮双（3 - 乙基苯并噻唑啉 - 6 - 磺酸）（ABTS）阳离子自由基和羟基自由基（OH・）的清除率均超过 80%。同时，它能抑制大肠杆菌（E. coli）、金黄色葡萄球菌（S. aureus）和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的生长（细菌存活率较低），作用机制是破坏细菌细胞膜（经扫描电子显微镜（SEM）观察证实）。

2.7 不对称多孔 SFMA/BSAMA/TP 水凝胶的细胞内活性氧清除作用

AP S20B10T 水凝胶可缓解过氧化氢（H₂O₂）诱导的大鼠骨髓间充质干细胞氧化应激。2',7'- 二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）、5,5',6,6'- 四氯 - 1,1',3,3'- 四乙基苯并咪唑基羰花青碘化物（JC-1）和线粒体超氧化物（Mito-Sox）红色荧光探针染色结果显示，在 S20B10T 和 AP S20B10T 水凝胶组中，细胞内和线粒体中的活性氧（ROS）水平降低，线粒体膜电位（MMP）得以维持。透射电子显微镜（TEM）观察发现，茶多酚可保护线粒体免受活性氧损伤，线粒体嵴结构正常，且线粒体数量比 H₂O₂处理组和 S20B10 水凝胶组更多。

2.8 不对称多孔 SFMA/BSAMA/TP 水凝胶的体外成骨分化作用

AP S20B10T 水凝胶能促进大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化。碱性磷酸酶（ALP）染色（7 天）和茜素红 S（ARS）染色（14 天）结果显示，S20B10T 和 AP S20B10T 水凝胶组中碱性磷酸酶活性更高，钙结节数量更多，其中 AP S20B10T 水凝胶组效果最佳（得益于茶多酚和保留的 Ca²⁺）。实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）结果显示，该水凝胶组中碱性磷酸酶（ALP）、Ⅰ 型胶原（COL-1）和骨桥蛋白（OPN）等成骨相关基因的 mRNA 表达水平显著上调。

2.9 不对称多孔 SFMA/BSAMA/TP 水凝胶的体内牙周骨再生作用

在大鼠皮下植入实验中，AP S20B10T 水凝胶表现出良好的组织相容性，轻微炎症反应逐渐消退，未对器官造成损伤，且在体内的留存时间比 Bio-Gide 膜更长。在大鼠牙周缺损模型中（6 周和 12 周），显微计算机断层扫描（micro-CT）结果显示，AP S20B10T 水凝胶组的骨体积 / 总体积（BV/TV）、骨表面积 / 总体积（BS/TV）和骨矿物质密度（BMD）最高，骨小梁分离度（Tb. Sp）最低，12 周时缺损部位几乎被新生骨填满。组织学染色（苏木精 - 伊红（H&E）染色、马松三色染色、骨桥蛋白（OPN）免疫荧光染色）结果证实，AP S20B10T 水凝胶组新生骨组织更多，软组织侵入更少，骨桥蛋白表达水平更高，效果优于 Bio-Gide 膜组。

3. 结论

本研究采用茶多酚调控策略制备出高强度、高韧性的蚕丝蛋白 / 牛血清白蛋白水凝胶。茶多酚通过非共价相互作用调控蛋白质的二级结构（增加 β- 折叠结构含量）并形成物理交联，使水凝胶的强度和韧性达到平衡，其拉伸强度为（2.64±0.20）MPa、杨氏模量为（60.37±2.71）MPa、断裂伸长率为（206.80%±2.78%）、韧性为（1.83±0.13）MJ/m³。不对称多孔水凝胶膜（具有致密侧和多孔侧）力学性能优良、降解缓慢，且具备抗氧化、抗菌和促成骨等特性，在体内能有效促进牙周骨再生。该策略不仅可用于制备骨引导再生膜所需的高强度高韧性天然蛋白质基水凝胶，还可推广应用于其他需要优异力学性能和微环境调控能力的生物医用水凝胶。不过，本研究存在局限性，需在大型动物模型、更大尺寸缺损模型中验证其效果，并阐明其促成骨作用的分子机制。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.celbio.2025.100223

来源：高分子凝胶与网络