《食品科学》：中国农业大学李全宏教授等：南瓜籽抗氧化肽的制备表征及其对H2O2损伤Caco-2细胞的保护作用

南瓜是传统农业中的重要蔬菜之一，南瓜籽具有药食两用功效，含有蛋白质、脂肪酸、多糖、维生素、单宁、类胡萝卜素、角鲨烯、植物甾醇等物质，其含有的功能性成分在预防人类疾病和促进人类健康方面都起到关键作用。许多研究表明，南瓜籽提取物具有驱虫、抗癌、抗糖尿病和降血糖、抗菌等作用。南瓜籽蛋白是南瓜籽加工后的产物。

近年来，从南瓜籽蛋白制备肽的相关研究中，较多集中于抗氧化肽。本研究以脱脂南瓜籽粉为原料，采用亚临界水解法制备南瓜籽多肽，对制备的多肽进行抗氧化活性分析、结构表征，并进一步通过超滤和反相高效液相色谱（RP-HPLC）法纯化得到南瓜籽抗氧化肽。利用H2O2诱导的Caco-2细胞氧化损伤模型，评估南瓜籽抗氧化肽对细胞氧化损伤的保护作用。

中国农业大学食品科学与营养工程学院的韩蕈泽、于文珺、李全宏*等研究旨在为南瓜籽的深度开发和高值化利用提供理论支持，同时为开发具有抗氧化功能的南瓜籽多肽产品奠定基础。

1南瓜籽多肽纯度及体外抗氧化活性评价

南瓜籽多肽的纯度和得率分别为70.12%和88.54%（数据未展示）。ABTS阳离子自由基及DPPH自由基清除能力被广泛应用于评估肽的抗氧化活性。体系内的抗氧化剂会抑制绿色的ABTS阳离子自由基生成，因此于734 nm波长处测量吸光度可以判断其自由基清除能力。DPPH自由基溶解于无水乙醇呈深紫色，抗氧化剂使其颜色变浅，在517 nm波长处吸光度减弱，以此可判断抗氧化剂的自由基清除能力。南瓜籽多肽的抗氧化活性如图1所示，从DPPH自由基、ABTS阳离子自由基清除率及FRAP 3 个方面探究，可以看出在1～40 mg/mL质量浓度范围之间，随着南瓜籽多肽质量浓度增加，3 种体外抗氧化指标均提升，呈现出剂量依赖关系。

如图1A所示，当南瓜籽多肽的质量浓度从1 mg/mL增加到40 mg/mL时，DPPH自由基清除率从（28.80±0.09）%升高至（91.62±0.48）%。当南瓜籽多肽质量浓度从1 mg/mL增加到40 mg/mL时，其ABTS阳离子自由基清除率由（16.95±0.28）%升高至（83.55±0.37）%。金属离子还原能力也可以作为抗氧化能力的评价指标，如图1B所示，随浓度增加南瓜籽多肽的FRAP从（0.14±0.01）μmol/mL升至（0.83±0.08）μmol/mL。Barea等利用亚临界水处理可溶性鱼粉蛋白，以FRAP方法评估抗氧化能力，结果显示亚临界水处理的水解产物有较强的抗氧化能力。上述结果表明，通过亚临界水解法制备的南瓜籽多肽具有良好的抗氧化活性。

2 南瓜籽多肽分子质量分布

亚临界水解法制备的南瓜籽多肽的分子质量分布如图2所示，分布结果如表1所示，亚临界水解法处理后的水解物中＜500 Da的组分占28.09%，＜1 000 Da的组分占41.83%，说明亚临界水解法可以有效降解蛋白质分子，获得较多的小分子质量肽。肽的分子质量分布对其抗氧化能力有影响，较大分子质量的肽可能会产生空间位阻，因而自由基清除能力较低，与较大分子质量肽相比，低分子质量肽常表现出更强的抗氧化能力。Zhang Jixian等从小麦胚芽蛋白水解物中分离出不同分子质量肽组分，其中＜1 000 Da的肽组分与其他组分相比，具有更高的抗氧化活性。因此，亚临界水解法制备南瓜籽多肽的抗氧化能力与其含有较多低分子质量的肽有关。

3 南瓜籽多肽氨基酸组成分析

如表2所示，疏水性氨基酸相对含量为38.69%，疏水性氨基酸常出现在抗氧化肽序列中，通过提高脂溶性自由基和多不饱和脂肪酸的可及性，抑制氧化损伤。此外，组氨酸相对含量为2.81%，芳香族氨基酸相对含量为12.47%，芳香族氨基酸通过提供电子将自由基转化为稳定分子，同时通过共振结构保持自身的稳定性从而发挥抗氧化作用。谷氨酸和天冬氨酸的相对含量较高，分别为15.08%和10.80%，这两种氨基酸可以通过清除自由基或螯合金属离子的方式抵抗氧化。Nourmohammadi等用碱性蛋白酶水解南瓜籽粕蛋白质得到的多肽中疏水性氨基酸相对含量为33.49%，也表现出抗氧化能力。由此推断，南瓜籽多肽的抗氧化能力与其氨基酸组成有关。

4南瓜籽蛋白与南瓜籽多肽FTIR分析

FTIR是一种基于不同官能团有特异性谱带吸收峰进而分析蛋白质结构和构象特征的技术，蛋白质主要的红外吸收光谱是由不同的酰胺带吸收区组成，FTIR已被广泛用于表征蛋白质分子二级结构。

由图3可以看出，南瓜籽蛋白、南瓜籽多肽在583.04、594.90 cm-1左右有C＝O面外弯曲振动造成的酰胺VI带，在1 647.96、1 657.93 cm-1左右有C＝O伸缩振动造成的酰胺I带，在2 960.65、2 961.85 cm-1左右有饱和C—H伸缩振动，南瓜籽蛋白在1 532.77 cm-1附近的峰为蛋白酰胺II带中N—H的弯曲振动峰，而南瓜籽多肽在此处的吸收峰消失，说明酰胺II带含量减少。南瓜籽多肽及南瓜籽蛋白在3 368.54、3 400.10 cm-1具有O—H伸缩振动、N—H伸缩振动带，并且随着亚临界水解，该峰位相较于南瓜籽蛋白而言，向低波数移动且吸收峰更宽更强，表明肽分子中有更多的氢键，可能是因为水解导致分子中的亲水基团暴露，氢键增加。由此可见，南瓜籽蛋白质经过亚临界水解后，二级结构发生相应变化。

5 南瓜籽蛋白与南瓜籽多肽紫外光谱分析

蛋白质在特定的紫外波长范围有吸收光谱，对南瓜籽多肽、南瓜籽蛋白进行全波长紫外扫描，如图4所示，两种物质在280 nm波长左右都有吸收峰，根据研究可知，在260～280 nm波长处的吸收峰为芳香族氨基酸的吸收峰。南瓜籽多肽吸光度的增加可能是由于埋藏的疏水基团暴露或二级结构修饰导致的增色效应。其中，南瓜籽蛋白质的吸收峰在286 nm波长处，而南瓜籽多肽的吸收峰蓝移至281 nm波长处，表明亚临界水解对于南瓜籽蛋白的结构产生了一定的影响。

6 南瓜籽蛋白与南瓜籽多肽紫外光谱分析

6.1

超滤组分抗氧化能力

使用超滤装置，将南瓜籽多肽分离为组分A（＞10 kDa）、组分B（5～10 kDa）和组分C（＜5 kDa）3 个部分，并测定其抗氧化活性，3 种组分的DPPH自由基清除率及ABTS阳离子自由基清除率结果如图5所示。5 mg/mL样品组分A、B、C的DPPH自由基清除率分别为（57.47±0.78）%、（64.55±0.46）%、（76.14±0.55）%，ABTS阳离子自由基清除率分别为（42.87±0.32）%、（49.65±0.78）%、（57.01±0.42）%。其中，组分C的DPPH自由基清除能力和ABTS阳离子自由基清除能力显著高于另外两组及南瓜籽多肽组，故选择组分C进行RP-HPLC分离收集。Zhang Fang等利用超滤膜分离牡丹种子蛋白水解物，发现＜5 kDa的组分表现出最强的抗氧化活性。Xia Ji’an等发现超滤分离后的绿豆蛋白水解物体外抗氧化活性显著提高。许多研究表明，肽的分子质量会对多肽的抗氧化能力产生影响，较小分子质量的肽更容易与自由基反应。Liu Qianxia等在对绵羊皱胃蛋白多肽的研究中发现，分子质量最小（＜3 kDa）的组分表现出最高的自由基清除率。

6.2

南瓜籽多肽RP-HPLC分离

RP-HPLC法的应用原理是依据肽分子疏水性的不同，对肽组分进行分离，肽组分中疏水性较弱的部分先洗脱出，疏水性较强的组分后洗脱出，从而实现有效分离。超滤所得组分C的洗脱曲线如图6所示，依据洗脱时间不同进行分离并收集到两部分，按照洗脱时间标记为C1和C2。对分离组分C1、C2抗氧化能力进行比较，结果如图7所示，在5 mg/mL条件下，组分C1、C2的DPPH自由基清除率和ABTS阳离子自由基清除率分别为（48.53±0.57）%、（43.11±0.46）%和（81.27±0.13）%、（62.41±0.87）%，C2组均显著高于C1组，且高于相同质量浓度南瓜籽多肽的自由基清除率（图1A），故选用C2组分进行后续实验。

7 南瓜籽蛋白与南瓜籽多肽紫外光谱分析

7.1

南瓜籽抗氧化肽对Caco-2细胞的毒性作用

采用CCK-8法检测超滤所得组分C及RP-HPLC分离所得组分C2对Caco-2细胞的毒性作用。50、200、400、600、800、1 000 μg/mL质量浓度条件下C、C2组分作用于Caco-2细胞24 h，对细胞生长产生的影响如图8所示。与对照组相比，组分C、C2在50～400 μg/mL的质量浓度范围内对Caco-2细胞无明显毒性效应。故选用50、200、400 μg/mL质量浓度样品开展后续实验。

7.2

H2O2诱导Caco-2细胞损伤模型的建立

通过使用0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L H2O2与Caco-2细胞共同孵育2、4、6 h，构建H2O2诱导的Caco-2细胞氧化损伤模型。如图9所示，在相同处理时间下细胞存活率随H2O2浓度增加而降低。1.0 mmol/L H2O2预处理4 h和6 h时，其细胞存活率分别降为50.29%和47.88%，在该条件下，既能诱发Caco-2细胞氧化应激，又能保持细胞相对活力。相比之下，预处理4 h时间更短且更接近半数致死浓度，因此后续实验中使用的氧化损伤模型诱导条件为1.0 mmol/L H2O2诱导4 h。

7.3

南瓜籽抗氧化肽对氧化损伤Caco-2细胞的保护作用

如图10所示，其中模型组经处理后，细胞存活率显著下降至50.68%，接近半数抑制浓度。经过质量浓度为50、200、400 μg/mL的两种组分预处理后，细胞存活率与模型组相比均显著升高，说明两种组分对于H2O2诱导的氧化损伤Caco-2细胞均有保护作用。相同质量浓度下，组分C2处理的细胞存活率均显著高于组分C。随着组分C、C2质量浓度的增加，对氧化损伤Caco-2细胞的保护作用逐渐增强。

7.4

南瓜籽抗氧化肽处理对Caco-2细胞内ROS含量的影响

小分子荧光探针常用于评估细胞内ROS含量，以DCFH-DA形式添加，进入细胞后的DCFH无荧光，被ROS氧化后变为有荧光的二氯荧光素。H2O2诱导Caco-2细胞会引发细胞产生过量ROS，如图11所示，经H2O2诱导后的损伤组ROS含量显著升高，为对照组的1.49 倍，添加200 μg/mL的C、C2组分均可以显著降低ROS含量，当添加组分C、C2质量浓度为400 μg/mL时，ROS含量分别为对照组的1.26 倍和1.11 倍，较损伤模型组下降15.44%和25.50%，与氧化损伤模型组差异显著，并且同质量浓度C2组分ROS含量显著低于C组分。因此，组分C、C2对氧化应激细胞的保护可以从其ROS清除能力角度解释，且C2组分表现优于C组分。Li Chen等从鲈鱼中提取抗氧化肽作用于氧化损伤Caco-2细胞后，细胞中的ROS水平也呈现相同趋势。Yao Hongliang等氨基酸组成分析表明，抗氧化性差异主要来源于抗氧化氨基酸组成差异，精氨酸含量较高的产物具有较高抗氧化活性。

7.5

南瓜籽抗氧化肽处理对Caco-2细胞内DNA含量的影响

ROS攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸会引起脂质过氧化产生MDA，MDA含量常反映细胞脂质氧化损伤程度，MDA含量越高，细胞氧化损伤程度越重。如图12所示，经过H2O2处理后的模型损伤组细胞内MDA含量与对照组相比显著升高，使用不同质量浓度组分C、C2对细胞进行预处理后，MDA含量均有所下降且与添加浓度呈现剂量依赖关系。这与Mohammad等使用H2O2诱导大鼠心脏组织的氧化损伤，经南瓜籽提取物处理组的MDA含量较损伤模型组显著降低，并且呈现剂量依赖的结果一致。相同质量浓度C2组分处理后的MDA含量均低于C组分，当两种组分质量浓度为400 μg/mL时，细胞内的MDA含量显著下降，因此C、C2两种组分对于细胞的脂质过氧化均有显著改善作用。

7.6

南瓜籽抗氧化肽处理对Caco-2细胞内SOD、CAT含量的影响

SOD和CAT是重要的抗氧化酶。SOD作为细胞抵抗自由基第1道防线的重要组成部分，可以防止细胞氧化损伤，CAT可以催化分解细胞代谢产生的H2O2。SOD和CAT等酶驱动的氧化防御体系可以消除自由基以保持细胞氧化还原稳态。如图13所示，使用H2O2处理的氧化损伤Caco-2细胞SOD和CAT活性明显下降，分别为17.47、1.77 U/mL，显著低于对照组的20.67、6.58 U/mL。与损伤模型组相比，不同浓度C、C2组分处理组SOD和CAT活性均显著提升，经400 μg/mL C、C2组分处理后，其SOD活性分别为19.53、20.05 U/mL，均显著高于损伤模型组；CAT活性分别为4.38、5.04 U/mL，均显著高于模型损伤组。实验结果表明，C、C2组分可以提高Caco-2细胞抗氧化酶活性，减轻细胞的氧化损伤。

结论

本研究通过亚临界水解法从脱脂南瓜籽粉中制备出南瓜籽多肽，并分析了其抗氧化活性。研究发现，所制备的多肽具有显著的体外抗氧化能力，能有效清除DPPH自由基和ABTS阳离子自由基，并具有FRAP。通过超滤和RP-HPLC法进一步纯化分别得到抗氧化肽C、C2组分，在H2O2诱导的Caco-2细胞氧化损伤模型中显示出良好的保护作用，显著提高细胞存活率，降低ROS和MDA含量，增强SOD和CAT活性。综上，南瓜籽抗氧化肽具有潜在的细胞保护功能，可为南瓜籽的深度开发和高值化利用提供理论依据，并为南瓜籽抗氧化肽作为新型抗氧化剂应用于抗氧化功能食品或保健品奠定基础。

作者简介

通信作者：

李全宏，教授，博士生导师，农业农村部谷物加工企业重点实验室主任、世界中餐业联合会中餐工业化产业分会联席主席、中国园艺学会南瓜专业委员会副会长、中国质量认证中心（CQC）认证技术委员会检测技术分委会委员、联合国工业发展组织（UNIDO）中国投资与技术促进处绿色产业专家。先后主持国家级科研项目11 项、省部级科研项目15 项、横向课题16 项，培养硕博士研究生77 人，发表论文160 余篇，获授权专利17 项，制修订国家标准、团体标准等近10 项，获省部级科研奖励9 项、行业科研奖励2 项。

本文《南瓜籽抗氧化肽的制备表征及其对H2O2损伤Caco-2细胞的保护作用》来源于《食品科学》2025年46卷第18期146-154页，作者：韩蕈泽，于文珺，张 雨，赵 婧，李全宏*。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250224-117。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑：北京化工大学王小云；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网