环形 RNA 癌症疫苗：抗癌战场上的新晋潜力股

摘要：在癌症免疫治疗的浪潮中，RNA 疫苗一直备受关注。而如今，一种名为环形 RNA（circRNA）的特殊分子正异军突起，成为癌症疫苗开发的新方向。与传统线性 RNA 相比，环形 RNA 凭借其独特的闭环结构拥有更强的稳定性和持续表达能力，在抗原生产和免疫激发上展现出显著优势。本文将从环形 RNA 的发现历程、疫苗设计原理、合成纯化技术、递送策略，到当前的临床探索与未来挑战，带大家全面解锁这一抗癌新武器的奥秘。

一、环形 RNA：从发现到成为疫苗新宠

大家可能对 mRNA 疫苗并不陌生，但环形 RNA 的发现和应用则是近年来的科研突破。早在上世纪 70 年代，科学家首次在植物病原类病毒中发现了这种呈共价闭合环状结构的 RNA 分子，后来又在真核细胞中证实了它的存在。天然的环形 RNA 主要通过 “外显子剪接” 过程形成，常扮演着 “微小 RNA 海绵” 的角色，调控基因表达。

真正让环形 RNA 走进抗癌领域的，是人工体外合成技术的成熟。与线性 RNA 不到 20 小时的半衰期相比，人工合成的环形 RNA 半衰期可达 168 小时，能持续表达抗原，这一特性让它具备了成为疫苗平台的核心潜力。此前针对新冠病毒的环形 RNA 疫苗已展现出优势 —— 不仅抗原产量更高、更持久，还能诱导产生更多中和抗体和针对性免疫反应。在癌症治疗中，它同样表现亮眼，比如在小鼠肿瘤模型中，环形 RNA 疫苗能有效激发抗肿瘤免疫，为后续研究奠定了基础。

值得注意的是，天然环形 RNA 本身就与癌症密切相关。像 circNUP50 会促进卵巢癌对顺铂的耐药性，而 circHERC1 则与非小细胞肺癌的进展相关，这些异常表达的环形 RNA 既是癌症标志物，也为疫苗靶点选择提供了灵感。目前全球已有多项针对环形 RNA 的临床试验正在开展，涵盖乳腺癌、肝癌、结直肠癌等多种癌症。

表 1 环形 RNA 相关疗法的临床试验

二、量身定制：环形 RNA 癌症疫苗的设计秘诀

要打造一款高效的环形 RNA 癌症疫苗，设计环节至关重要。科研人员需要从多个维度进行优化，确保疫苗能精准激发免疫反应，同时降低副作用。

首先是疫苗骨架的优化。环形 RNA 疫苗的核心是能编码抗原的开放阅读框（ORF），而内部核糖体进入位点（IRES）是启动翻译的关键元件。将 IRES 与 ORF 组成的组件作为核心，再加上促进环化的元件和降低免疫原性的序列，就能构建出疫苗的基础框架。研究发现，在 IRES 和目标基因之间加入间隔序列，优化非编码区（UTRs），能显著提升翻译效率。此外，由于长链环形 RNA 容易断裂，科研人员开始尝试用短开放阅读框（sORFs）表达免疫球蛋白新抗原，既保证免疫效果又提升稳定性。

其次是m6A 修饰的应用。m6A 是 RNA 上常见的甲基化修饰，给环形 RNA 加上这种修饰，能让它 “伪装” 成内源性核酸，避开机体的免疫监视，同时还能增强其抗核酸酶的能力，提升稳定性。有趣的是，这种修饰并不会影响抗原的翻译效率，可谓一举两得。研究还发现，一些癌蛋白的 m6A 修饰会促进肿瘤发生，这也为疫苗靶点的修饰提供了参考。

最后是新抗原的精准选择。个性化疫苗的核心是找到肿瘤特有的新抗原，这类抗原免疫原性强，能避免攻击正常细胞。比如在结直肠癌中，circRAPGEF5 和 circMYH9 编码的新抗原能激发特异性 T 细胞反应，这些 T 细胞还能精准识别并消灭肿瘤类器官。在肝细胞癌的研究中，编码 40 种新抗原的个性化环形 RNA 疫苗已展现出临床响应。不过，新抗原的筛选难度大、肿瘤特异性 T 细胞效能不足等问题，仍需进一步解决。

三、精雕细琢：环形 RNA 的合成与纯化

设计好的疫苗蓝图，还需要可靠的合成和纯化技术来实现。目前环形 RNA 的合成主要有三种方法，各有优劣。

化学合成法是利用溴化氰（BrCN）等偶联剂激活线性 RNA 前体，使其环化。这种方法能合成出可翻译的环形 RNA，但形成的非天然磷酸酰胺键可能存在生物安全性问题，限制了其应用。

酶促合成法常用 T4 RNA 连接酶，在 ATP 参与下将线性 RNA 的 5’磷酸端和 3’羟基端连接成环。T4 RNA 连接酶 I 适合短链 RNA，而连接酶 II 能高效合成环形 RNA，但可能产生副产物。通过优化前体序列和加入同源序列，能提升环化效率，且酶法合成的环形 RNA 免疫原性更低。

核酶合成法则适用于长链 RNA，利用 I 型或 II 型内含子的自催化剪接功能，通过置换内含子 - 外显子系统实现环化。此外，设计 RNA 结合蛋白（RBP）结合位点，也能促进线性前体的环化。

合成后的环形 RNA 需要经过严格纯化，才能用于疫苗制备。凝胶电泳可用于初步分离和质量控制，但不适合大规模生产。目前更常用的是 RNase R 酶解法，它能特异性降解线性 RNA，保留环形 RNA。高效液相色谱（HPLC）能实现大规模高纯度制备，还能去除体外转录的副产物。将体积排阻色谱（SEC）与 HPLC 结合，能进一步提升疫苗的均一性。不过，如何彻底去除断裂的环形 RNA，仍是纯化过程中的一大挑战。

图 1 环形 RNA 从线性 RNA 前体的合成过程。a 化学合成：经 T4 多核苷酸激酶（T4 PNK）和小牛肠碱性磷酸酶（CIAP）处理后，在偶联剂（BrCN 或 EDC）催化下实现 5’端磷酸与 3’端羟基的连接；b 酶促合成：T4 RNA 连接酶借助 DNA 夹板的互补碱基配对实现位点特异性连接；c 核酶合成：基于 I 型内含子的置换内含子 - 外显子（PIE）系统，将定制序列插入外显子区域，在游离鸟苷存在下自发环化并释放两个内含子片段。

四、精准投递：疫苗如何直达病灶

环形 RNA 带负电且分子量大，很难自行穿过细胞膜，因此高效的递送系统是疫苗发挥作用的关键。目前主要有以下几种递送方式：

直接注射是最简便的方法，裸露的环形 RNA 能被树突状细胞通过巨胞饮作用吸收，激发 T 细胞反应。但裸露 RNA 易降解，需要长期反复注射才能维持疗效，通常需与脂质体联用提升稳定性。

树突状细胞（DC）负载法是先在体外将环形 RNA 转染到 DC 中，再将其回输到体内。DC 是免疫系统的 “哨兵”，能高效呈递抗原。纳米通道电穿孔（NEI）技术能实现 68.3% 的转染效率，且对细胞毒性低，不影响 DC 的活性和成熟。不过这种方法成本高、操作复杂，限制了其规模化应用。

脂质纳米颗粒（LNPs）递送是目前最具潜力的方式。LNPs 生物相容性好，能包裹环形 RNA 穿越细胞膜，还能实现器官靶向递送。研究发现，用 LNPs 递送的环形 RNA 疫苗在多种小鼠肿瘤模型中都展现出强大的抗肿瘤效果。通过修饰 LNPs 的结构，比如加入甘露糖，还能实现淋巴节点的长期靶向递送，减少肝脏损伤等副作用。

此外，病毒样颗粒（VLP）和腺相关病毒（AAV）也被用于环形 RNA 递送，前者能高效包裹核酸，后者可介导环形 RNA 前体的持续表达。但这些递送系统仍处于早期研究阶段，效率和安全性有待进一步验证。

图 2 环形 RNA 疫苗的递送方式。a 环形 RNA 制成溶液后直接注射；b 体外通过纳米通道电穿孔（NEI）系统将环形 RNA 转染到树突状细胞（DCs）中，再回输到小鼠体内；c 利用微流控混合器将环形 RNA 包裹进脂质纳米颗粒（LNP）中进行递送；d 病毒样颗粒（VLP）包裹环形 RNA 递送；e 腺相关病毒（AAV）携带环形 RNA 前体进行递送。

五、临床探索与未来挑战

目前环形 RNA 癌症疫苗的研究主要集中在动物实验阶段，已取得不少突破性成果。比如 circRNAOVA-luc-LNP 疫苗，通过 LNPs 递送针对 OVA 抗原的环形 RNA，在小鼠肿瘤模型中实现了持续的抗原表达和强效的抗肿瘤免疫反应，为临床转化提供了有力支撑。

联合疗法是当前的研究热点。将环形 RNA 疫苗与 CAR-T 细胞疗法、免疫检查点抑制剂联用，能显著提升治疗效果。例如，编码细胞因子的环形 RNA 疫苗能调节肿瘤微环境，增强 PD-1 抗体的抑瘤作用；而 CXCL13 作为佐剂与环形 RNA 疫苗联用，能提升免疫保护的广度和安全性。在肝癌的临床研究中，个性化环形 RNA 疫苗与派姆单抗联用，已在多数患者中激发了特异性 T 细胞反应。

不过，环形 RNA 疫苗要真正走向临床，还面临诸多挑战。首先是抗原选择的精准性，如何利用人工智能技术高效筛选出免疫原性强的新抗原，是提升疫苗疗效的关键。其次是靶向递送系统的优化，需要进一步降低脱靶效应，提升疫苗在肿瘤部位的富集度。此外，外源性环形 RNA 与体内生物分子的相互作用可能引发未知副作用，大规模纯化的成本和生物安全性也需要重点攻克。

目前，尚无环形 RNA 癌症疫苗获得监管批准，多数临床试验仍处于早期阶段。但随着技术的不断进步，这些难题正逐步被破解。未来，环形 RNA 疫苗不仅有望用于癌症治疗，还可能在传染病预防等领域发挥作用。相信在科研人员的努力下，这一抗癌新武器终将走进临床，为癌症患者带来新的希望。