《食品科学》：暨南大学郑洁副研究员等：食品中柚皮素与丙酮醛形成的加合物及其细胞毒性评价

丙酮醛（MGO）是一种具有高反应活性的

多酚近年来被认为是MGO的有效清除剂，在抑制食品中衍生有害物如丙烯酰胺、甲基咪唑、AGEs等，以及阻断蛋白质、DNA、RNA交联和糖基化，预防慢性疾病方面具有极好的前景。柚皮素又称4’,5,7-三羟基二氢黄酮，主要存在于芸香科植物葡萄柚、西红柿及柑橘类植物的果皮和种子中。柚皮素为二氢黄酮类化合物，具有多种生物活性，如降血脂、抑菌消炎、抗氧化、抗癌、抗重金属毒性等，具备广泛应用于食品、医药领域的潜力。

暨南大学生物活性分子与成药性优化全国重点实验室的吴仲君、暨南大学生命科学技术学院的颜婷和郑洁*等采用模拟体系（37 ℃、pH 7.4）条件，探究柚皮素消除MGO及抑制AGEs生成的效果，通过加合物分离、纯化和结构表征，阐释柚皮素消除MGO的机理，并且在真实食品体系（饼干）中证实加合物的存在，并分析柚皮素添加量对饼干中MGO及柚皮素-MGO加合物形成的影响规律，最后通过细胞毒性评价初步评估柚皮素-MGO加合物的安全性，以期为柚皮素等多酚类物质应用于食品热加工过程中有害物的控制提供科学的理论指导。

1 柚皮素对MGO的消除作用

在模拟生理条件下（pH 7.4、37 ℃）测定24 h内柚皮素对MGO的消除率，结果如图1所示。结果表明随着反应时间延长，柚皮素对MGO的消除率逐渐增加。在反应进行30 min时，MGO消除率达到3.27%，1 h后达到6.80%，而后2 h消除率迅速升高至20.04%，在24 h时，消除率最高，达到了47.90%。根据Cömert等的研究，柚皮素属于具有“慢反应、高清除能力”的MGO清除剂，即需要更长的孵育时间才能达到较好的消除效果。与其他多酚如根皮素、表儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯、白藜芦醇、槲皮素24 h内对MGO的消除率分别为99.7%（k＝23.140 L/（mol·h））、99.4%（k＝12.755 L/（mol·h））、99.1%（k＝9.590 L/（mol·h））、60.5%（k＝0.128 L/（mol·h））、50.0%（k＝0.097 L/（mol·h））相比，柚皮素与MGO的反应速率常数较低（k＝0.015 L/（mol·h）），但在较长的反应时间内仍有不错的消除效果。

2 模拟条件下柚皮素对AGEs生成的抑制作用

研究表明MGO可与细胞内外蛋白质交联形成AGEs，而MGO和AGEs的形成与积累会引起羰基应激，诱发多种慢性及神经衰退性疾病，如糖尿病及其并发症、阿尔茨海默病等，但活性成分多酚可以通过抗氧化和捕获MGO的机制有效清除MGO及阻断AGEs的形成，本研究仅针对后一途径展开探究。本研究在模拟生理条件下（37 ℃、pH 7.4）测定24 h内柚皮素对BSA-MGO体系中荧光AGEs的抑制率，结果如图2所示。两组中AGEs的含量随时间的延长而增加，且同一时间点空白对照组的AGEs含量高于柚皮素添加组。与空白组相比，在反应时间为30 min时，柚皮素的加入对AGEs生成的抑制率是58.8%，随着反应时间延长，抑制率缓慢上升，在反应时间达到24 h时，抑制率升至69.7%。实验结果表明，柚皮素有效抑制AGEs的生成，且随着反应时间延长抑制效果逐渐提升，推测是因为柚皮素与体系中的部分MGO互作形成了加合物，从而阻断了这部分MGO与BSA结合形成AGEs。

3 加合物的分离纯化

柚皮素与MGO反应液的HPLC色谱图如图3所示，除柚皮素外，还产生了一个新加合物。后期经制备液相分离发现图3的加合物会分离为两个峰，如图4所示，因此将其命名为加合物a和加合物b。

通过HPLC分析发现，加合物a和加合物b的极性相差不大，因此本研究采用两步骤法分离纯化，即首先采用正相硅胶柱层析富集得到加合物a、b的混合物，再通过中低压半制备液相分离纯化得到纯度＞95%的加合物a和加合物b。

4 加合物的结构鉴定

采用HPLC-MS/MS分析发现两个加合物的分子质量和产生的碎片离子信息基本一致，因此推测两个物质为同分异构体，加合物的一级、二级及高分辨质谱图如图5所示（以加合物a为例）。在负离子扫描模式下，加合物的分子离子峰为m/z 343（[M－H]－），说明其相对分子质量为m/z 344（272＋72），由此推测其可能为一分子柚皮素（相对分子质量为272）和一分子MGO（相对分子质量为72）加合而成的产物。高分辨质谱显示，加合物的准确相对分子质量为343.080 9，分子式为C18H16O7。进一步分析其二级谱可知，加合物的分子离子峰脱去一分子水，在其二级质谱中产生了含量很高的m/z 325的碎片，同时m/z 119和m/z 205的碎片离子提示加合物的B环和C环发生了断裂，MGO应该与柚皮素A环的C6或C8位点发生了加成反应。

对加合物a和加合物b的1H、13C的NMR化学位移信号进行归属，结果如表1所示。NMR结果显示，MGO的羰基结合到柚皮素A环上的C8位点形成了加合物a和加合物b，并且两者核磁信号差异不大，说明加合物a与加合物b为空间异构体，推测是C11-OH处出现了空间异构现象。加合物a和加合物b化学名均为8-(1-羟基丙酮)-柚皮素。

5 柚皮素强化饼干中MGO和加合物的含量变化

鉴于天然膳食多酚可以有效消除MGO以形成多酚-MGO加合物，但在真实食品体系中研究较少的现状，本研究将以饼干为研究对象，分析柚皮素添加量对焙烤食品中MGO及柚皮素-MGO加合物形成量的影响规律。图6为添加1 g/kg柚皮素制作的饼干样品的MS谱，其中黑色曲线为总离子流图，加合物a和b为图中双峰，结果表明在真实的食品体系中有柚皮素-MGO加合物产生。如图7所示，饼干中MGO的减少量和加合物的生成量均与柚皮素的添加量呈显著的剂量依赖关系，随着柚皮素添加量的增加，MGO的含量逐渐减少，而加合物的生成量逐渐上升。未添加柚皮素的空白组检测到241 mg/kg MGO，说明MGO在高糖高油的食品中大量产生。当柚皮素添加量达到最大，即1.0 g/kg时，饼干中MGO含量为70 mg/kg，比空白组低70%，同时加合物的含量达到47.44 mg/kg，该结果表明焙烤食品中添加柚皮素可以通过与MGO形成加合物的形式有效降低其食品中MGO的含量，且柚皮素添加量越大，降低效果越显著。

6 MGO、柚皮素、加合物的细胞毒性评估

鉴于柚皮素消除MGO的机理是发生亲电加成反应形成新的加合物，而目前对于这些新发现的加合物的安全隐患却鲜有研究。本实验以柚皮素与MGO作为对照，探究加合物对3 种细胞系（GES-1、Caco-2、Qsg-7701）的细胞毒性大小，初步评估加合物的安全性，结果如图8所示。柚皮素、MGO和加合物处理的3 种细胞系的存活率与样品浓度存在剂量依赖关系，同一细胞系同一物质处理下，随着样品浓度增加，细胞活力均呈下降趋势，其中Caco-2细胞对MGO、柚皮素和加合物表现出的耐受力高于GES-1和Qsg-7701细胞。

如图8A所示，对于GES-1细胞，MGO、柚皮素和加合物处理细胞24 h后，半数抑制浓度（IC50）值分别为771.8、381.3 μmol/L和374.5 μmol/L，说明加合物的细胞毒性比MGO高，与柚皮素相当。在加合物处理浓度分别为200、300、400、500 μmol/L时，GES-1细胞存活率分别为79.5%、51%、40%、35%，继续提高处理浓度至600～900 μmol/L时，细胞存活率基本不变，维持在32%左右，在最大处理浓度1 000 μmol/L时，细胞存活率降到最低（26.7%）。在低处理浓度范围（0～500 μmol/L），与加合物相比，柚皮素的细胞毒性略小，当柚皮素处理浓度分别为200、300、400、500 μmol/L时，细胞活力分别为80%、64%、45%、38%。在高浓度范围（600～1 000 μmol/L），GES-1对柚皮素更敏感，即加合物的毒性低于柚皮素，其中在处理浓度达到700 μmol/L时，柚皮素组细胞活力为18%，而同等处理浓度下加合物组的细胞活力为33%，在处理浓度高于700 μmol/L时，柚皮素组细胞活力无显著变化（P＜0.05），维持在15%左右。

对于Caco-2细胞（图8B），结果显示加合物的细胞毒性比MGO高，比柚皮素低。随着加合物处理浓度上升，细胞活力显著下降（P＜0.05），即处理浓度由200 μmol/L上升至1 000 μmol/L，细胞存活率由96%下降至64%。对于柚皮素组，处理浓度由200 μmol/L上升至1 000 μmol/L时，细胞存活率由88%下降至61%，其中在高浓度范围（600～1 000 μmol/L）时细胞毒性大小变化不显著（P＜0.05）。

对于Qsg-7701细胞（图8C），MGO、柚皮素和加合物处理细胞24 h后，IC50值分别为724.9、525.3、601.0 μmol/L，说明加合物的细胞毒性比MGO高，比柚皮素低，介于两者之间。随着加合物处理浓度上升，细胞活力显著下降（P＜0.05），其中处理浓度由200 μmol/L增加至1 000 μmol/L时，细胞活力由90%下降至21%。当柚皮素处理浓度由200 μmol/L增加至1 000 μmol/L时，细胞存活率由93%下降至20%，其中在最小处理浓度200 μmol/L时，柚皮素组的细胞存活率高于同浓度处理下的加合物组，继续提高处理浓度，柚皮素组的细胞存活率均低于同浓度处理下的加合物组。

综上所述，加合物的细胞毒性高于MGO，比柚皮素低或相当。虽然加合物的细胞毒性高于MGO，但MGO本身属于低毒物质，其主要危害来源于它会在食品加工过程中进一步形成衍生有害物，如丙烯酰胺、5-羟甲基糠醛、杂环胺、甲基咪唑、AGEs等，或经人体吸收代谢后修饰蛋白质、核酸等大分子物质形成AGEs，进而诱发一系列慢性疾病。而柚皮素属于天然膳食多酚类，广泛存在于柚子、柑橘类植物，富含柚皮素的水果具有广泛食用安全的历史，鉴于加合物细胞毒性不高于天然膳食多酚柚皮素的结果，提示柚皮素消除MGO形成的加合物安全风险低。

结 论

本研究在模拟生理体系条件（37 ℃、pH 7.4）下，发现柚皮素对MGO的消除率和AGEs的抑制率均随时间延长而增加，在24 h时，MGO消除率达到47.90%，AGEs抑制率达到69.7%，推测柚皮素与体系中的部分MGO互作形成了加合物，从而阻断了这部分MGO与BSA结合形成AGEs。经消减产物分离纯化及结构表征确定其消除机理为：柚皮素A环的C8位点与MGO发生亲电加成反应而形成加合物。在真实食品体系（饼干）中，柚皮素对MGO的消除率和加合物的形成水平均随柚皮素添加量的增加而上升，在最大添加量1.0 g/kg时，MGO的消除率为70%，加合物的含量为47.44 mg/kg。鉴于加合物存在于真实食品体系中，并会随食品摄入体内，本研究采用GES-1、Caco2、Qsg-7701 3 种细胞系评估加合物的细胞毒性发现，加合物的细胞毒性总体不高于膳食多酚柚皮素。上述结果说明柚皮素可以有效降低MGO和AGEs的形成水平，同时其消除MGO的产物细胞毒性较低，属于一种安全高效的MGO清除剂，具有较好的应用前景。后续可针对加合物的生物活性，如抗氧化、抗炎、抗癌、抑菌能力等，及在体内的吸收、代谢及其对健康的长期影响进行更深入的研究。

作者简介

通信作者：

郑洁，副研究员，博士生导师，广东省焙烤食品安全粤港联合创新平台副主任，广东省农村科技特派员。入选广东省“珠江人才计划”青年拔尖人才、广东省百名博士博士后创新人物，主要研究领域为热加工食品安全控制与功能性食品开发。主持国家自然科学基金青年及面上项目、芬兰自然科学基金国际合作项目等纵向课题10余项；主持横向课题4 项。发表论文76 篇，其中SCI论文55 篇（中科院1区/TOP论文38 篇，ESI高被引2 篇），

H

Frontiers in Nutrition

eFood

Foods

Journal of Agricultural and Food Chemistry，Food Chemistry

第一作者：

吴仲君，助理实验师，暨南大学生物活性分子与成药性优化全国重点实验室。

教育经历：2017.9-2021.6 暨南大学 食品质量与安全 本科；2021.9-2024.6 暨南大学 生物与医药 硕士。

研究方向：多酚、氨基酸与活泼羰基化合物的作用机制研究。

科研经历：参与国家自然科学基金青年基金1 项。

本文《 食品中柚皮素与丙酮醛形成的加合物及其细胞毒性评价 》来源于《食品科学》2025年46卷第15期60-66页，作者： 吴仲君，颜婷，杨晓怀，李红良，黄才欢，欧仕益，郑洁 。DOI: 10.7506/spkx1002-6630-20250117-129 。点击下方 阅读原文 即可查看文章相关信息。

实习编辑：安宏琳；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

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