慢病毒载体生产中的挑战：生产细胞系的自转导

摘要:慢病毒载体（LVs）是基因治疗的 “搬运工”，能把治疗基因稳定送入细胞，可它的生产过程却藏着一个大麻烦 ——“自转导”（retro-transduction）。简单说，就是生产慢病毒的细胞，会被自己造出来的病毒感染，导致 60%-90% 的病毒白白浪费，还影响细胞活力和病毒质量。本文就从 “自转导” 的危害说起，拆解科学家们尝试的解决办法，包括有争议的 LDLR 基因敲除、简单易操作的 pH 调节，还有能 “一箭双雕”的 ENV-Y 新技术，带大家看看基因治疗背后的生产难题如何被逐步攻克。

一、基因治疗的 “得力助手”，却有个 “自坑” 的毛病

提到基因治疗，就不得不说慢病毒载体（LVs）这个 “关键选手”。它最大的本事，是能把治疗用的基因稳定整合到分裂细胞和非分裂细胞里，不管细胞活不活跃，都能完成 “基因投递” 任务，这也是它成为细胞和基因治疗（CGT）核心工具的原因。

可这么好用的慢病毒，生产起来却特别费劲。之前科学家们解决了产量低、稳定性差等问题，但还有个叫 “自转导”（retro-transduction）的现象，一直没得到足够重视。简单讲，就是生产慢病毒的细胞（叫 “生产细胞”），会被自己刚造出来的慢病毒 “反咬一口”—— 病毒钻进生产细胞里，导致本该收集起来用于治疗的病毒，全被生产细胞 “自己用了”。

为啥会出现这种情况？关键在于慢病毒生产中常用的“外衣”——VSV-G 糖蛋白（水疱性口炎病毒 G 糖蛋白）。这种蛋白就像慢病毒的 “钥匙”，能找到细胞表面的LDLR 受体（低密度脂蛋白受体），帮病毒打开细胞大门。而生产慢病毒的 HEK293 (T) 细胞表面，刚好就有很多 LDLR 受体，这就给慢病毒 “回头感染生产细胞” 创造了条件。

自转导的危害可不小：首先，会让能收集的感染性慢病毒减少 60%-90%，相当于大部分病毒都白造了，大大增加生产成本；其次，病毒钻进生产细胞后，会在细胞里积累基因片段，可能影响细胞的生长速度和活力，甚至让细胞产生更多杂质，增加后续提纯难度；更麻烦的是，丢失的往往是感染性最强的病毒，最后剩下的病毒 “战斗力” 会变差。

二、自转导有多严重？实验数据告诉你答案

为了搞清楚自转导在实际生产中的影响，科学家们用两种常见的生产系统做了实验：一种是贴壁生长的生产细胞（在细胞堆叠培养器里培养），另一种是悬浮生长的生产细胞（在搅拌式生物反应器里培养），用的都是常用的GPRG和GPRTG 稳定细胞系。

他们通过数字droplet PCR（数字液滴聚合酶链反应），检测生产细胞里 “被自转导进去的病毒基因拷贝数（VCN）”，结果让人惊讶：

悬浮培养的生产细胞中，不同克隆的 VCN 差异很大，其中克隆 56 在培养第 11 天，每个细胞里竟然有 469 个病毒基因拷贝（图 1B）；

贴壁培养的生产细胞，经过 5 天培养后，每个细胞的病毒基因拷贝数最高能到 229 个（图 1D）。

更关键的是，根据病毒总产量和细胞密度推算，两种生产系统里，有 87%-97% 的感染性病毒都因为自转导被消耗了！而且实验还发现，细胞分泌到上清液里的病毒滴度，和细胞内的病毒基因拷贝数没有相关性（图 1C），这说明就算细胞造病毒的能力强，也可能因为自转导导致实际收获的病毒少。

不过不同悬浮细胞克隆的自转导趋势不一样：有的克隆（比如克隆 45）在达到一定 VCN 后会进入平台期，不再增加；有的克隆（比如克隆 56、102、155）则会先升后降。科学家推测，这可能是因为有些病毒基因没稳定整合到细胞基因组里，或者是 VCN 太高影响了细胞生长，导致高 VCN 的细胞被淘汰，整体平均 VCN 就下降了。

图1 稳定诱导型贴壁和悬浮生产细胞系表达 WAS-T2A-GFP 慢病毒时的自转导研究

图 1 说明：（A）慢病毒生产实验设计和自转导机制示意图，悬浮细胞在 5L 搅拌式生物反应器中培养，贴壁细胞在 10 层细胞堆叠培养器中培养；（B）不同悬浮生产细胞克隆在培养期间的病毒基因拷贝数变化；（C）对应悬浮细胞培养的病毒感染滴度；（D）贴壁生产细胞在诱导前和培养 5 天后的病毒基因拷贝数。

三、破解自转导的 3 类方法：各有优劣，谁能胜出？

面对自转导这个 “拦路虎”，科学家们尝试了多种方法，目前主要有三类方向，各有特点。

1. 争议不断的 “LDLR 基因敲除”：有人成功，有人失败

既然 VSV-G 是通过结合 LDLR 受体实现自转导，那如果把生产细胞里的LDLR 基因敲除，让细胞表面没有 LDLR 受体，是不是就能阻止自转导？

不同研究团队的结果却大相径庭：

有的团队成功了：Schaser 团队用 CRISPR-Cas9 敲除 HEK293T 细胞的 LDLR 基因后，自转导减少了 45%，病毒产量提高，而且 VSV-G 对细胞的毒性也降低了（因为减少了细胞融合）；Han 团队也发现，敲除 LDLR 基因后病毒滴度翻倍，他们认为这是因为减少了 VSV-G 在细胞内的降解。

有的团队却失败了：Banos-Mateos 团队敲除 LDLR 基因后，虽然自转导确实减少了，但病毒产量没提高，甚至有的克隆产量还下降了。后来发现，LDLR 基因和细胞的胆固醇代谢有关，敲除后细胞胆固醇水平降低，而胆固醇对慢病毒的感染性和稳定性很重要，这就导致病毒 “战斗力” 下降。

作者团队自己也做了实验：他们用稳定的 GPRG-GFP 贴壁生产细胞，敲除 LDLR 基因后，4 个敲除克隆的自转导都减少了（VCN 从野生型的 112 降到 24-77，图 2A），但只有 1 个克隆（KO1）的病毒滴度明显提高（从 5.85×10⁶ TU/mL 升到 1.07×10⁷ TU/mL，图 2B），其他克隆要么和野生型差不多，要么更低。

这说明，LDLR 基因敲除不是 “万能药”，得针对不同细胞克隆单独测试，而且还要担心 CRISPR-Cas9 技术可能带来的脱靶效应，一不小心可能破坏其他重要基因。

图2 稳定 GPRG-GFP 生产细胞克隆中 CRISPR-Cas9 介导的 LDLR 基因敲除结果

图2 说明：（A）生产结束后，通过数字液滴 PCR 检测的细胞内病毒基因拷贝数（自转导指标），野生型（WT）和 4 个敲除克隆（KO1-4）对比；（B）3 次连续收获的病毒合并后，检测的感染滴度对比。

2. 简单易操作的 “小技巧”：加抗体、调 pH，各有门道

除了基因敲除，还有一些更 “轻量级” 的方法，操作简单，不用改造细胞。

加 “阻断剂” 阻止结合：有团队尝试在培养体系里加抗 VSV-G 抗体，或者让生产细胞过量表达可溶性 LDLR—— 这些分子能先和慢病毒的 VSV-G 结合，让病毒没法再结合生产细胞的 LDLR 受体，从而减少自转导。不过这种方法有个问题：加进去的阻断剂后续要从病毒产品里去掉，增加了提纯难度，而且也没提高病毒产量。

调低培养体系 pH：这是 Williams-Fegredo 团队发现的 “小妙招”。他们发现，VSV-G 蛋白在不同 pH 下会变构：中性或高 pH 时是 “前融合构象”，能结合 LDLR 受体；酸性 pH（6.7-6.8）时会变成 “后融合构象”，没法结合受体。于是他们在细胞转染后，把培养体系 pH 调到 6.7-6.8，结果自转导减少了 7 倍！而且虽然病毒峰值滴度和正常 pH 差不多，但峰值能维持更久，如果用连续收获的方式（灌注培养），就能收集到更多病毒。这种方法不用加东西，也不用改细胞，成本低还容易放大，很有应用潜力。

3. 一箭双雕的 “ENV-Y 新技术”：既防自转导，又好提纯

作者团队最近开发了一种叫ENV-Y的融合蛋白，能同时解决自转导和提纯两个问题，堪称 “神操作”。

ENV-Y 的结构很巧妙：一部分是 LDLR 的 VSV-G 结合域，能像 “钩子” 一样抓住慢病毒的 VSV-G，阻止病毒感染生产细胞，减少自转导；另一部分是抗体的 Fc 片段，而 Fc 片段能和蛋白 A 配体特异性结合，这就给病毒提纯提供了便利 —— 后续只要用蛋白 A 层析柱，就能把结合了 ENV-Y 的慢病毒 “抓” 出来，再用酸性缓冲液（pH<6.2）加 EDTA 洗脱就行（VSV-G 在酸性条件下会和 ENV-Y 解离，EDTA 还能进一步促进分离）。

目前的初步实验显示，ENV-Y 能高效结合 VSV-G，还能 dose-dependent（剂量依赖性）地减少病毒对细胞的感染。如果后续能让生产细胞稳定表达 ENV-Y，既能持续阻止自转导，又能简化提纯步骤，对慢病毒大规模生产来说是个大好事。

四、未来展望：慢病毒生产还有哪些方向可探索？

虽然目前有了不少应对自转导的方法，但还有很多问题需要解决：比如大部分研究都是在 “瞬时转染” 系统里做的，而现在越来越多人用 “稳定生产细胞系”，这些方法在稳定细胞系里的效果还需要更多验证；LDLR 基因敲除、RAP 过表达等方法，可能影响细胞代谢，需要找到更安全的改造方式。

未来还有几个值得关注的方向：

优化灌注培养：灌注培养能持续移除培养体系里的病毒，减少病毒和生产细胞的接触时间，从而降低自转导。不过要平衡灌注速率，太快会稀释病毒，增加成本，还需要更多实验找到最佳参数。

筛选小分子抑制剂：如果能找到一种小分子，既能阻止 VSV-G 和 LDLR 结合，又不影响细胞代谢，还容易被去除，那就能轻松解决自转导问题，这种方法成本低、易推广，值得期待。

开发新的 “病毒外衣”：除了 VSV-G，科学家还在尝试用麻疹病毒、狂犬病病毒等的糖蛋白作为慢病毒的 “外衣”，这些蛋白只结合特定细胞的受体，如果生产细胞表面没有这些受体，自然就不会发生自转导。不过新的 “外衣” 需要重新做安全性评估，周期会比较长。

慢病毒生产的每一个小进步，都能让基因治疗离临床更近一步。虽然自转导这个难题还没被完全攻克，但从基因敲除到 pH 调节，再到 ENV-Y 这样的创新技术，科学家们正在一步步找到更优解，相信未来慢病毒的生产效率会越来越高，成本越来越低，让更多基因治疗药物能惠及患者。