Cell 子刊 | 兼容FFPE样本！新型高通量单细胞多组学平台GoT-Multi，可实现多靶点基因型与转录组共检测

体细胞进化会引发肿瘤克隆异质性，这是癌症进展和治疗耐药的核心驱动因素。目前，人们通常使用批量测序或单细胞测序两种方法来推断克隆进化轨迹，以揭示癌症进展过程中的遗传优化机制；但传统方法难以分离亚克隆，解析原发性癌症样本中克隆异质性的下游分子效应一直存在挑战。

单细胞RNA测序（scRNA-seq）虽能高分辨率绘制异质性癌细胞状态，但无法直接解析单个癌细胞中转录状态与致癌驱动突变（除大片段拷贝数变异外）之间的相互作用；现有其他方法受限于多位点突变、FFPE样本等复杂情况，无法系统揭示克隆结构与细胞状态间的关联。因此，目前亟需开发一种能够兼容多种样本类型，并实现多靶点基因型与全转录组共检测的技术。

近日，美国威尔康奈尔医学院和阿德莱德大学研究人员合作开发了新型单细胞多组学技术GoT-Multi，其整合了高通量转录组测序与多重体细胞基因型检测，能够同时捕获单个癌细胞中多个突变位点及其全转录组信息。该技术兼容包括FFPE在内的多种样本类型，并引入了基于机器学习的分析流程（GoT-Multi-ML）检测非线性突变模式，以优化基因分型。研究团队将GoT-Multi应用于Richter转化（RT）样本中，同时追踪了超27种不同基因突变的存在情况，观察了癌症进展过程中这些突变与细胞活性的关联。总之，GoT-Multi提供了癌症向更高侵袭性和治疗耐药性方向进化的新见解。

GoT-Multi的核心在于将基于探针的单细胞RNA测序与多重体细胞基因分型相结合。该技术基于10× Genomics固定RNA分析平台，利用定制设计的基因分型探针（突变、野生型及通用探针），实现对转录组与体细胞突变的共捕获。每个探针包含基因型特异性条码和PCR接头，提高了分型准确性，还使基因型与转录组文库可独立构建并平行测序。此外，该技术支持细胞哈希（Cell Hashing）技术，最多可将4个样本混合检测，显著降低试剂成本，且不受转录本末端限制，克服了传统poly (A) 捕获技术无法检测远端突变的缺陷。

研究团队还开发了配套分析流程GoT-Multi-ML，该流程利用随机森林、多层感知器等集成模型，通过学习突变靶点相关非线性特征，有效区分真实突变与由非特异性结合、环境RNA等引起的假阳性信号，进一步提升基因分型的准确性和可靠，可广泛应用于其他单细胞基因分型方法。

接下来，研究团队对GoT-Multi进行了评估，首先在MCF-7和SK-BR-3乳腺癌细胞系混合样本中进行测试。结果显示，引入野生型探针并经GoT-Multi-ML去噪处理后，GoT-Multi实现了较高的基因分型准确率与特异性，HIST1H1C和S100A10两个突变的准确率分别为96.81%和97.78%。在人UT-7与小鼠Ba/F3细胞混合实验中，GoT-Multi实现了CALR和IDH2等关键突变的高精度分型，还可对混合样本进行多重分析，在保证100%和99.98%分型准确性的同时，减少了批次效应。上述结果证明了GoT-Multi在复杂原代样本中同步进行多重突变检测与全转录组分析的强大能力与实用性。

图1. GoT-Multi在数千个单细胞中共捕获多个突变和全转录组

研究团队进一步将GoT-Multi用于RT转化原代样本中，追踪慢性淋巴细胞白血病（CLL）向侵袭性大B细胞淋巴瘤（LBCL）进展的克隆演化与表型关联，包括冷冻组织与FFPE样本。结果显示，在5例样本中分析了约5万个细胞，共识别出增殖、CCND2高表达、炎症反应、应激反应等多种异质性细胞状态；其中，增殖状态和CCND2高表达状态在LBCL中显著富集，而应激反应状态则在CLL中更常见。

研究团队还使用GoT-Multi，对18个批量DNA测序鉴定的体细胞突变进行分析，发现捕获的中位准确率高达98%，且多数靶点分型率超20%，显著优于传统poly(A)捕获方法。此外，结合转录组数据，研究团队发现这些突变在样本中呈现不同的克隆演化模式：部分突变（如EMD、B2M、IRF8、JUNB）特异性存在于LBCL，或在LBCL相关细胞状态（如增殖、GC-B状态）中富集；而其他突变（如SRRM2）与癌细胞表型无关。

图2. GoT-Multi共映射了RT转化中的遗传和细胞状态异质性

通过将GoT-Multi与癌细胞分数（CCF）、拷贝数变异（CNV）相结合，研究团队揭示了RT样本中的复杂的克隆结构，并发现亚克隆通常与特定细胞状态相关。与BTK抑制剂耐药相关突变克隆（PLCG2 p.L845F、PLCG2 p.D993H、BTK p.C481S）显著富集于炎症及免疫反应细胞状态；而非耐药PLCG2 p.S1079R克隆则主要富集于增殖状态；此外，亚克隆的细胞状态富集与突变转录本的表达水平无关。这表明不同的耐药突变可能通过驱动相似的炎症性转录状态来介导治疗耐药。

通过转录组对比，研究团队识别了亚克隆突变下游的异常基因表达。差异表达分析显示，耐药克隆上调炎症、抗凋亡基因，突变效应随细胞状态变化。通路富集显示，不同亚克隆突变可能趋同于共同的下游转录状态，如PLCG2和SRRM2突变克隆激活TNF /干扰素通路，IRF8、POU2F2突变激活MYC，这提示趋同转录状态介导耐药。此外，研究团队还发现亚克隆间可能通过TNF等信号分子进行细胞间通讯。上述结果凸显了同时解析克隆与转录程序对阐明耐药和疾病进化的重要性。

图3. GoT-Multi揭示了RT转化中治疗耐药亚克隆的趋同信号通路

作为临床中最常见的样本形式，研究团队测试了GoT-Multi与FFPE样本的兼容性。结果显示，在RT FFPE样本中，GoT-Multi分离了2,140 个具有高RNA质量的细胞核（每个细胞的中位数为4,670个UMI和2,513个基因），成功鉴定出GC-B、记忆 B 细胞、浆细胞及肿瘤微环境细胞。对9个特定突变靶点的检测率为2%-29%，平均准确率98%。克隆进化分析显示，携带NOTCH1与FBXW7突变的亚克隆分别富集于CCND2高表达、后生发中心B细胞等特定细胞状态，进一步证实了GoT-Multi在临床存档样本中开展高分辨率克隆演化研究的可行性。

图4.GoT-Multi解析RT FFPE样本中亚克隆的克隆结构和表型身份

综上所述，GoT-Multi作为一种高通量、多靶点、兼容FFPE样本的单细胞多组学平台，突破了现有技术在通量、灵活性与样本适应性方面的限制。该技术不仅为癌症克隆演化与细胞异质性的共映射提供了强大工具，也揭示了在治疗抵抗过程中不同基因型趋向于相似转录状态的生物学现象；其广泛应用将推动对肿瘤进化机制的理解，并为联合治疗策略的开发提供新思路。

https://www.cell.com/cell-genomics/fulltext/S2666-979X(25)00292-7

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