PCE | 仅需1对引物，解决蛋白互作及亚细胞定位的载体构建

蛋白质是生命活动的主要执行者，在植物生长发育及逆境适应性中起重要作用。然而，蛋白质极少单独行动，它们更像一个精密协作网络中的成员，通过“蛋白质-蛋白质相互作用”形成复杂的复合体，从而传递信号、执行功能。验证一对蛋白的相互作用通常需要使用4-5种方法，目前最常用的蛋白互作验证包括酵母双杂交（Yeast Two-Hybrid）、双分子荧光互补（BiFC）、荧光素酶互补（Split-LUC）、下拉实验（Pull-down）及蛋白质免疫共沉淀（Co-IP）等。每种蛋白互作实验分别需要构建不同的载体，因此，验证1对蛋白互作需要针对每个基因设计4-5对引物，做4-5次PCR及4-5次PCR产物回收，才能将目的基因克隆到不同的互作载体中，不仅引物设计和克隆过程复杂，而且成本高昂。

近日，湖南大学生物学院伍斗生/于峰课题组在国际知名期刊Plant, Cell & Environment发表了题为One Primer Pair for All: A Standardized Vector Toolbox for Protein-Protein Interactions and Protein Localization in Plants的技术报告。

该文章基于In-Fusion克隆技术，首先改造了常用蛋白互作载体克隆区域的酶切位点，改造后的载体均使用BamHI和SalI进行酶切（命名为PPI-BS），无需购买多余的酶；其次改造了BamHI和SalI酶切位点上下游的同源重组序列。改造后的载体工具盒PPI-BS，针对1个基因只需要设计1对引物，做1次PCR反应及产物纯化，便可通过In-Fusion反应将目的基因克隆至任意的蛋白质互作及亚细胞定位载体中，极大地简化了蛋白互作等载体构建中的引物设计、PCR反应及回收等过程，同时还极大地节约了载体构建的成本，包括引物合成、PCR试剂及产物回收试剂等。改造后的PPI-BS载体已提交至Addgene，可预订后获取，也可联系通讯作者获取PPI-BS载体及图谱。

湖南大学生物学院伍斗生教授为通讯作者，湖南大学生物学院硕士研究生罗彩琳、博士研究生王立海天及硕士研究生吴玉琴为共同第一作者，博士研究生蔡俊及硕士研究生彭滨参与了该工作，湖南大学于峰教授及陈佳博士（现西北农林科技大学副教授）指导了本工作的开展。该研究得到了国家自然科学基金、中国科协青年人才托举计划及湖南省青年科技人才等项目的资助。

全文链接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pce.70219