神经环路应用（14）：GRIN透镜植入技术实验案例应用

GRIN透镜植入是一种用于在体深部脑区进行长期、高分辨率神经元活动成像的关键技术。通过外科手术将微型GRIN透镜植入目标脑区（如前边缘皮层、海马、丘脑等），结合微型显微镜（miniscope）或双光子显微镜，可在自由活动动物中实现对同一群神经元数周甚至数月的动态观测。该技术突破了传统成像的深度限制，支持钙信号、突触传递及神经网络活动的单细胞水平记录。GRIN透镜植入通常与病毒标记（如GCaMP）结合使用，广泛应用于学习记忆、决策行为、社交互动等神经环路功能研究。其核心优势在于实现长期稳定、细胞分辨率、深部脑区的在体成像，是当前神经科学研究中解析神经编码与行为关系的重要工具。

GRIN透镜的作用：

作为 “光学通路”，其特殊的梯度折射率结构能将深部脑区的荧光信号高效传导至脑表面，配合微型显微镜捕捉信号，最终实现单细胞分辨率的在体钙成像。当小鼠处于操作性条件反射（如按压杠杆获取食物/可卡因）的自由活动状态，也能精准记录单个神经元的钙活动。

第一阶段：手术操作

包含两步核心手术，为后续成像打基础：

病毒注射：将携带 GECIs 基因的病毒注入 PrL，让目标神经元表达钙指示剂，使神经元活动可被荧光 “标记”；

GRIN 透镜植入：在 PrL 脑区植入 GRIN 透镜，搭建从深部神经元到脑表面的 “光学通道”，确保荧光信号能有效传出。

第二阶段：功能记录（结合行为范式）

例如，在小鼠进行 “食物自我给药” 和 “可卡因自我给药” 两种操作性行为时，通过微型显微镜连接 GRIN 透镜，实时记录 PrL 神经元的钙信号，实现 “行为-神经活动” 的同步追踪。

Fig1 GRIN透镜植入过程

实验步骤：

病毒注射

第一阶段为病毒注射手术，耗时约一小时，术后需恢复七天。

在专用无菌区域进行术前准备：铺置一次性手术巾与吸水垫，金属器械经玻璃珠灭菌器高温灭菌，针头按说明处理以防损伤。远离手术区剃除小鼠头部毛发以避免污染。置于麻醉诱导舱中，通过氧气输送异氟烷诱导麻醉，待呼吸减慢后以脚趾夹捏反射确认深度。持续经鼻罩维持麻醉，并定期监测呼吸与反射。迅速转移至立体定位仪，用耳杆和门齿夹固定，双眼涂眼膏防干燥，腹部放置加热垫维持体温。暴露头皮后，用消毒液清洁并以乙醇或无菌水冲洗。沿中线切开皮肤，钝性分离软组织，彻底暴露颅骨。于前边缘皮层定位开颅，钻孔时持续用生理盐水冷却，穿透硬脑膜即停。提前将病毒从冰箱取出冰上解冻，24小时内使用。连接细针头至微量注射器，依次吸入生理盐水、空气泡和病毒液，利用气-液界面追踪输注过程。轻推排出少量病毒确认通畅后，精确定位并缓慢注射。留针数分钟促进扩散。骨蜡封闭颅窗，丝线缝合皮肤，涂抹抗生素软膏。逐渐降低麻醉浓度助其苏醒，转入恒温恢复箱观察数小时。术后皮下注射镇痛药，饮水中添加非甾体抗炎药连续多天。密切观察恢复情况，7天后进入下一阶段手术。

第二阶段为GRIN透镜植入手术

术前肌肉注射抗炎药以减轻脑水肿。所有器械灭菌后，腹腔注射麻醉小鼠并固定于立体定位仪，维持体温。切除头皮，去除骨膜，涂抹超级胶水封闭边缘。清理颅骨，钻孔开窗，全程生理盐水冷却防热损伤。穿透硬脑膜后停止。校准坐标系统，定位前囟与植入点，设定并锁定零点。启动灌注-吸引系统，重力驱动预热人工脑脊液持续灌注；程序控制分层吸引，由粗到细，边吸边冲，促进组织清除与血管自愈，无需止血剂。

操作中使用体视显微镜配合冷光源实时观察，及时用无菌纱布和棉签吸除多余液体。启动自动吸引程序，逐层清除脑组织，直至目标深度。达到目标后，再进行一次清洁性吸引，重复数次直至基底无可见出血，随后继续灌注人工脑脊液数分钟，促进残余血管闭合。确认无出血后撤出吸引针。

使用镊子夹取GRIN透镜，缓慢将其插入已清理的腔道中，确保透镜周围完全被人工脑脊液填充，无气泡或血液残留，以免影响后期成像质量。随后使用粘合剂从透镜周围开始向外圈状涂抹第一层牙科水泥，待其初步固化后，再涂第二层牙科水泥，等待足够时间完全固化。最后，将剪裁好的PCR管底部用超级胶水固定于透镜上方，形成保护罩，注意避免胶水接触透镜表面。

术后立即给予皮下注射镇痛药物和无菌生理盐水以防脱水，将小鼠置于恒温箱中直至完全清醒。术后连续多天提供含非甾体抗炎药的饮水。植入后需允许长达四周的恢复期，在此期间每日记录小鼠的体重、活动状态、伤口愈合情况及其他生理行为变化，确认无感染或神经功能缺损后方可进行后续光纤成像实验。

文献引用：

• Wang J, Wang B, Wang MW, Beacher NJ, Lin DT, Zhang Y. Protocol for recording neuronal activity in food and cocaine self-administration in freely behaving mice using calcium imaging. STAR Protoc. 2025 Sep 19;6(3):103972. doi: 10.1016/j.xpro.2025.103972. Epub 2025 Jul 22. PMID: 40700008; PMCID: PMC12305217.

• Zhang, L., Liang, B., Barbera, G., Hawes, S., Zhang, Y., Stump, K., Baum, I., Yang, Y., Li, Y., and Lin, D.T. (2019). Miniscope GRIN Lens System for Calcium Imaging of Neuronal Activity from Deep Brain Structures in Behaving Animals. Curr. Protoc. Neurosci. 86, e56. https://doi.org/ 10.1002/cpns.56.

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