《食品科学》：渤海大学范金波教授等： 4种酪氨酸酶抑制剂的两两联合作用机制

酪氨酸酶（TYR）是一种含铜金属酶，是合成黑色素的限速酶，在色素生成、果蔬褐变中发挥重要作用。故抑制TYR的活性对黑色素瘤和大多数色素沉着的辅助治疗具有重要作用。黄酮类化合物是一类重要的天然TYR抑制剂。课题组预实验研究发现，槐角苷（Sop）、葛根素（Pue）、芒果苷（Man）具有不同的TYR抑制能力。

然而，单一组分的抑制剂进行应用时，通常需要使用较高剂量才能达到预期的抑制效果。联合作用时由于小分子之间或小分子与蛋白之间的相互影响，可能会发挥协同增效的作用。

渤海大学食品科学与工程学院的苏冬雨、刘祎和范金波*等人通过联合作用指数确定其两两联合的抑制效应，通过竞争结合实验和抑制率实验进一步研究协同抑制组合的添加顺序，借助多光谱法系统地探究协同作用机制。以期联合抑制可以减少单一抑制剂用量，优势互补，对防治色素性皮肤病、控制果蔬酶促褐变和Sop、Pue、Man功能食品的开发提供实验依据。

01

联合抑制作用分析

如图1所示，在所研究范围内时，Sop＋KA、Sop＋Pue和Man＋KA的CI＜1，这3 个组合为协同作用；而其余组合CI＞1，均展现为拮抗作用。在Sop＋Pue组合中，联合抑制达到50%抑制率时，Pue的用量较单独发挥抑制作用时减少49.61%，Sop减少56.89%；在Sop＋KA组合中，Sop较单抑制剂用量减少46.22%，KA减少54.47%；在Man＋KA组合中，KA较单抑制剂用量减少60.49%，Man减少52.18%。由此可见，联合抑制大大减少了各抑制剂的用量，发挥协同增效的作用。

02

联合抑制作用下添加顺序的确定

通过荧光猝灭率实验分别对Sop＋Pue、Man＋KA、Sop＋KA 3个协同组合的添加顺序进行研究，结果如图2所示。在所研究浓度下，Sop＋Pue组合没有结合的先后顺序，两者相互影响，影响程度微小。Man会轻微影响KA与TYR的结合，具体表现在猝灭率的降低；而TYR KA-Man较TYR-Man猝灭率基本不变，这表明KA并不影响Man与TYR结合。同理，较TYR单独与Sop结合时，KA与TYR的提前结合使猝灭率降低，说明KA会阻碍酶与Sop的结合，而Sop的提前加入并没有影响KA与酶的结合。结果表明抑制剂的不同添加顺序会对TYR与抑制剂的结合产生影响，Sop＋Pue、Man＋KA、Sop＋KA此3种组合的添加顺序依次为无顺序、TYR-KA-Man、TYR-Sop-KA。

因此，按不同添加顺序依次进行抑制率的测定。由图3可以看到，Sop＋Pue和Man＋KA组合的抑制率并没有太大的差异，表明受结合顺序影响并不大。Sop＋Pue组合中，抑制率的从大到小顺序为TYR＋Sop＋Pue＞TYR-Pue-Sop＞TYR-Sop-Pue，说明

1 与 TYR 结合后，会阻碍

2 与 TYR 的结合，两者相互影响，但差异微弱，与荧光猝灭率结果一致。 Man ＋ KA 组合中， TYR ＋ Man ＋ KA 、 TYR-Man-KA 、 TYR-KA-Man 的抑制率接近，即添加顺序并不影响两者对 TYR 抑制作用，可能因为两者的主要抑制类型不同，抑制机制互补。 Sop ＋ KA 组合中，抑制能力大小差异明显，为 TYR-Sop-KA ＞ TYR ＋ Sop ＋ KA ＞ TYR-KA-Sop ，这是因为 KA 会阻碍 Sop 与 TYR 的结合，说明 Sop 要先于 KA 与 TYR 结合，不同添加顺序下抑制率结果与荧光猝灭率实验结果一致。抑制率实验结果表明， Sop ＋ Pue 、 Man ＋ KA 、 Sop ＋ KA 此 3 种组合的添加顺序依次为 TYR-Pue-Sop 、无顺序、 TYR-Sop-KA 。综上， 3 种组合的添加顺序确定为 TYR-Pue-Sop 、 TYR-KA-Man 、 TYR-Sop-KA 。

03

荧光光谱

如图4所示，随着多酚浓度的增加，TYR的固有荧光强度呈规律性猝灭。使用Stern-Volmer方程和双对数回归方程探讨了双抑制剂对TYR的猝灭机理，相关计算结果见表1。在所研究的浓度范围内，在I1 存在下，F0/F与I2浓度呈现出良好的线性关系，表明为单一猝灭类型。TYR-Pue-Sop和TYR-Sop-KA随温度的升高猝灭常数Ksv降低，同各自的单抑制剂处理组TYR-Sop、TYR-KA一样，均为静态猝灭；TYR-KA-Man则同TYR-Man一样，生物分子猝灭速率常数Kq远大于2.0×1010L/（moL·s），也为静态猝灭。这意味着，在I1存在下，I2依然能与TYR相互结合，形成双抑制剂-TYR复合物。双抑制剂的结合常数Ka值均大于104L/mol数量级，表明I2与TYR-I1复合物具有较强的结合亲和力；结合位点数n≈1，表明I2在TYR-I1复合物上存在单一的多酚结合位点。TYR-Pue-Sop的结合常数Ka较TYR-Sop无较大差别，且n≈1，说明两者不存在竞争关系，具有不同的结合位点。TYR-KA-Man与TYR-Man也是如此。对于TYR-Sop-KA组合，TYR-Sop-KA的结合常数较TYR-KA略微增加，说明Sop的加入稍稍增强了KA与游离TYR的结合，这可能是两者发挥协同效应的原因之一。

多酚与TYR结合的热力学参数通过van’t-Hoff方程计算得到，结果见表2。与单抑制剂相比，驱动双抑制剂结合的主要作用力没有变化，TYR-Pue-Sop的ΔG＜0、ΔH＜0、ΔS＞0，表明静电相互作用是Sop与TYR-Pue 结合的主要驱动力；TYR-Sop-KA的ΔG＜0、ΔH＜0、ΔS＜0，表明KA与TYR-Sop的结合以氢键和范德华力为主；TYR-KA-Man的ΔG＜0、ΔH＞0、ΔS＞0，表明疏水相互作用为Man与TYR-KA结合的主要作用力。此外，随Man添加浓度增加，TYR-KA-Man最大吸收波长蓝移，说明微环境更加疏水，也与之相印证。

04

TYR的粒径变化

单抑制剂与双抑制剂作用后TYR的粒径见图5。Man和KA加入后较单独酶体系粒径显著增大，且TYR-Man和TYR-KA两体系差异显著；Sop和Pue加入后粒径相较于单独酶时显著降低，而两体系差异不显著。在联合抑制中，Pue的加入对TYR-Sop体系来说，粒径并没有显著变化。而TYR-Sop-KA体系粒径较TYR-KA体系显著降低，可能是Sop的优先加入使TYR-KA的结合更加紧密，同时荧光光谱表明TYR-Sop-KA的结合常数较TYR-KA略微增加，两者相互验证。同理，KA的加入使TYR-Man体系粒径显著降低，可能是KA促进了Man与TYR的结合，与结合常数结果一致。

05

红外光谱

由图6可知，抑制剂对TYR结构的影响主要在3600～2900cm－1波数范围。O—H和N—H的伸缩振动在3300 cm－1左右，由于氧原子电负性很大，羟基之间会形成氢键，可以将多个分子缔合在一起，表现为宽峰；而R—NH2由于存在两个氢原子，N—H的伸缩摆动就会形成一个肩峰（3439 cm－1和3350 cm－1处）。TYR-Sop-KA和TYR-Pue-Sop复合物在3600～3300 cm－1处变得更宽、更光滑，表明联合抑制剂-TYR复合物改变了单抑制剂-TYR复合物原有的氢键结合模式，O—H类型的氢键变为主导，表明抑制剂中的羟基基团与TYR的羰基基团之间存在相互作用。而TYR-KA-Man肩峰更明显，并且峰强度变低，则可能是因为游离氢键O—H减少，N—H 氢键类型突出，表明TYR的氨基基团与抑制剂中的羰基基团之间存在相互作用。3450～3300 cm－1处峰位置的移动和峰强度的变化意味着氢键是稳定TYR-抑制剂复合物的重要作用力，可能与抑制剂的多羟基结构有关，此现象也在绿原酸-牛血清白蛋白偶联物中检测到。在2960 cm－1处峰的位移证明TYR和抑制剂之间存在疏水相互作用，可能是抑制剂的苯环与TYR芳香族氨基酸形成

π-π

堆积，Roy等在黄芩素与牛血清白蛋白的相互作用中也发现了类似的现象。

用酰胺I谱带（1700～1600 cm－1）定量分析加入不同抑制剂反应后TYR的二级结构，结果见表3。

-螺旋结构主要通过多肽上羰基氧C＝O和氨基氢NH—之间的氢键稳定，这种内氢键相互作用能够增强结构的稳定性。按IC 50 浓度比例加入抑制剂，

-螺旋结构的占比均减小，TYR-KA-Man减小程度最大，其次为TYR-Pue和TYR-KA；除TYR-KA-Man外，其余样品的

-折叠含量均有所提高，因此推测，TYR-KA-Man较TYR样品来说，结构更加无序且不稳定。比较

-螺旋、

-折叠和无规卷曲的占比，推测TYR-Sop-KA、TYR-Pue-Sop、TYR-Man也趋于向无序状态转变。而TYR-Sop、TYR-Pue、TYR-KA的

-螺旋结构含量下降，

-折叠含量增加，

-折叠结构由分子间氢键维持，因此推测TYR构象的转变是由于Sop、Pue、KA破坏了TYR的分子内氢键，抑制剂的羟基与蛋白质氨基 氮之间形成氢键，驱动TYR的

-螺旋向

-折叠转变。

06

不同抑制剂作用下TYR的差示扫描量热曲线

图7显示，TYR-Pue-Sop的热变性熔融温度（

T

m）值低于TYR-Pue和TYR-Sop，TYR-Sop-KA的

T

m

值低于TYR-Sop和TYR-KA，TYR-KA-Man的

T

m值低于TYR-KA和TYR-Man，而通常认为

T

m的减小代表蛋白稳定性的降低，因此，TYR-二元抑制剂复合物发挥联合抑制的机制之一可能是降低了TYR-单抑制剂复合物的热稳定性，使其更容易变性。

结论

本研究通过联合作用指数确定联合抑制类型，发现Pue＋Sop、Sop＋KA、KA＋Man组合为协同作用，联合抑制大大减少了各抑制剂的用量（46.22%～60.49%）；通过竞争结合实验和抑制率实验确定添加顺序为TYR-Pue-Sop、TYR-Sop-KA、TYR-KA-Man。荧光光谱显示，双抑制剂与TYR形成了酶-双抑制剂三元复合物；结合常数的增加和粒径的降低表明Sop、KA分别促进了TYR-KA、TYR-Man的结合，使其结合更加紧密。推测

1 使

2 结合常数的增加是 Sop-KA 、 KA-Man 产生协同作用的原因之一。双抑制剂与 TYR 形成了酶 - 双抑制剂三元复合物，

1 的存在并没有改变

2 原有的作用力类型， TYR - Pue-Sop 以静电相互作用为主， TYR-Sop-KA 以氢键和范德华力为主， TYR-KA-Man 以疏水相互作用为主要驱动力。通过红外光谱和差示扫描量热结果推测，联合抑制可能降低了单抑制剂时 TYR 的稳定性，使其更易变性。探索联合作用机制，可以减少单一抑制剂的用量，优势互补，进一步为其作为潜在的减少色素沉着药物的应用提供理论支持。然而，在实际应用中，有必要进行细胞或动物实验，深入研究细胞毒性、体内抑制机制和生物利用度等指标。

作者简介

通信作者：

范金波，教授，渤海大学食品科学与工程学院副院长，主要从事果蔬加工、功能活性成分开发及分子营养学方面的教学、科研以及社会服务工作。现任中国农业工程学会农产品加工及贮藏工程分会委员，中国食品科学技术学会果蔬加工技术分会委员，辽宁省食品科学技术学会委员。2020年获得辽宁省优秀硕士学位论文指导教师称号。主持“十四五”国家重点研发计划专项子课题1 项，教育部语言合作与交流中心创新项目1 项，教育部协同育人项目3 项，辽宁省科技特派团项目2 项，辽宁省教育厅项目2 项，辽宁省一流课程1 门。参与“十三五”项目、国家自然基金项目、省部级和横向项目10余项；作为主要完成人获得辽宁省学术成果奖二等奖1项，锦州市学术成果奖2 项，辽宁省教学成果一等奖2 项、二等奖2 项，主编专著2 部；以第一或通信作者发表论文60余篇（其中SCI/EI收录20余篇），授权国家发明专利5 件；指导学生参加学科竞赛获国家级大赛一等奖1 项，省级一等奖3 项。

第一作者：

苏冬雨，渤海大学食品科学与工程学院硕士研究生，研究方向为食品活性成分开发及利用。

本文《4种酪氨酸酶抑制剂的两两联合作用机制》来源于《食品科学》2025年46卷第8期8-15页，作者：苏冬雨，刘 祎，班晨宇，张瀛心，周素珍，范金波*。DOI：10.7506/spkx1002-6630-20240419-181。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑：魏雨诺；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

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