生物反应器指南：病毒疫苗生产中的参数控制与工艺优化

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摘要：本文聚焦《Bioreactor Design Concepts for Viral Vaccine Production》第三章 “病毒疫苗生产的生物反应器设计理念”，从疫苗生产的细胞基础切入，系统解析生物反应器的选型依据、操作模式优化、关键工艺参数控制，以及疫苗生产全流程的质量保障体系。文中结合具体病毒疫苗（如流感、新冠疫苗）的生产案例，阐述生物反应器如何通过精准控制细胞培养环境，实现病毒高效增殖与疫苗安全产出，同时梳理不同类型生物反应器的优势与适用场景，为读者揭示生物反应器设计与病毒疫苗生产需求的深度匹配逻辑。一、病毒疫苗生产的细胞基础：细胞系选择与培养特性

病毒无法独立增殖，需依赖宿主细胞完成复制，因此宿主细胞系的选择与培养，是病毒疫苗生产的首要环节，也直接决定生物反应器的设计方向。

1.1 常用疫苗生产细胞系及其特性

不同病毒对宿主细胞的需求不同，目前疫苗生产中主流的细胞系主要分为哺乳动物细胞、昆虫细胞等，各有明确的应用场景：

Vero 细胞：源自非洲绿猴肾细胞，是应用最广泛的疫苗生产细胞系之一。其优势在于无干扰素（IFN）产生能力，不会抑制病毒复制，且可贴壁或悬浮培养，适用于脊髓灰质炎疫苗、流感疫苗、新冠灭活疫苗（如国药集团新冠疫苗）的生产。在生物反应器中，Vero 细胞常通过微载体（如 Cytodex-1）实现贴壁培养，或适应悬浮培养后在搅拌罐生物反应器中大规模增殖。

MDCK 细胞（Madin-Darby 犬肾细胞）：属于上皮细胞，对流感病毒等呼吸道病毒亲和力高，是流感疫苗（如 Flucelvax）生产的核心细胞系。MDCK 细胞可悬浮培养，在波浪式生物反应器或搅拌罐生物反应器中，能高效支持流感病毒复制，且病毒滴度高、抗原性好。

PER.C6 细胞：源自人类视网膜母细胞瘤细胞，具有无限增殖能力，可悬浮培养且无需血清，适用于腺病毒载体疫苗（如埃博拉疫苗、新冠腺病毒载体疫苗）的生产。该细胞系在固定床生物反应器中可实现高细胞密度培养，大幅提升病毒载体产量。

CHO 细胞（中国仓鼠卵巢细胞）：虽主要用于重组蛋白生产，但通过基因工程改造后，也可用于病毒样颗粒（VLPs）疫苗（如 HPV 疫苗）生产。CHO 细胞对营养需求明确，在无血清培养基中可稳定悬浮培养，适合在搅拌罐生物反应器中进行大规模生产。

HEK293 细胞（人胚肾细胞）：常用于病毒载体（如腺病毒、慢病毒）的生产，具有转染效率高、病毒包装能力强的特点，在实验室研发和中试阶段应用广泛，可在波浪式生物反应器或一次性搅拌罐生物反应器中培养。

表 1：病毒疫苗生产常用细胞系及适用场景

1.2 细胞培养的关键需求：为生物反应器设计奠基

宿主细胞的培养特性直接决定生物反应器的核心设计参数：

贴壁细胞 vs 悬浮细胞：贴壁细胞（如 Vero 细胞）需附着在固体表面（如微载体、固定床基质）生长，因此需选择支持贴壁培养的生物反应器（如固定床生物反应器、微载体搅拌罐生物反应器）；悬浮细胞（如 MDCK、PER.C6 细胞）可在液体培养基中自由生长，适用范围更广，搅拌罐、波浪式、气升式生物反应器均可使用。

血清依赖 vs 无血清培养：传统细胞培养依赖胎牛血清（FBS）提供营养，但血清存在批次差异大、潜在污染风险（如外源病毒）的问题。目前疫苗生产多采用无血清培养基，这要求生物反应器具备更精准的营养供给控制（如补料系统），避免营养不足导致细胞生长停滞。

高细胞密度需求：病毒复制依赖宿主细胞，高细胞密度可提升病毒产量。因此生物反应器需具备高效的氧气传递（如通气系统、搅拌设计）和废物移除能力（如 perfusion 系统），维持细胞长期稳定生长。

二、生物反应器选型：匹配病毒疫苗生产需求的 “精准选择”

生物反应器的选型是病毒疫苗生产的关键决策，需结合疫苗类型（如灭活疫苗、载体疫苗）、细胞系特性、生产规模等因素综合判断，核心是实现 “细胞生长需求” 与 “反应器功能” 的匹配。

2.1 不同类型生物反应器的优势与适用场景（1）悬浮培养生物反应器

适用于悬浮细胞（如 MDCK、PER.C6 细胞），核心优势是混合均匀、细胞接触营养充分，主要包括：

搅拌罐生物反应器（STR）：通过搅拌器实现培养基混合与氧气传递，参数控制精准（温度、pH、溶解氧可实时调节），可扩展性强，可从几升扩展至数千升，是流感疫苗、新冠 mRNA 疫苗大规模生产的首选。例如，Novavax 公司利用 2000L 搅拌罐生物反应器生产重组蛋白新冠疫苗，通过优化搅拌速度（避免剪切力损伤细胞）和通气量，实现高细胞密度培养。

气升式生物反应器：利用导流管形成循环流，无机械搅拌部件，剪切力低，适合对剪切敏感的细胞（如昆虫细胞）培养，可用于病毒样颗粒（VLPs）疫苗生产，能减少细胞损伤，提升产物稳定性。

波浪式生物反应器：属于一次性生物反应器（SUB），通过平台上下运动产生波浪式搅拌，无需机械部件，污染风险低、操作灵活，适合小规模研发或紧急疫苗生产（如新冠疫苗应急中试），最大容量可达 500L，且可快速切换生产批次。

（2）贴壁培养生物反应器

适用于贴壁细胞（如 Vero 细胞），核心是提供大比表面积供细胞附着，主要包括：

固定床生物反应器：以微载体、多孔纤维为固定基质，细胞附着在基质上生长，可实现高细胞密度（可达 10⁸ cells/mL），适用于脊髓灰质炎疫苗、乙肝疫苗生产。例如，某生物制药公司利用固定床生物反应器生产脊髓灰质炎疫苗，通过控制培养基流速和氧气供给，细胞密度较传统培养提升 3-5 倍，病毒产量同步增加。

中空纤维生物反应器：利用中空纤维分隔细胞培养区和培养基流动区，纤维提供大比表面积（可达 1000 m²/m³），且能高效传递营养和移除废物，适合长期培养（如病毒持续生产），可用于狂犬病疫苗生产，维持细胞稳定生长超过 2 周。

多层培养瓶/CellSTACK：属于小规模贴壁培养设备，通过多层结构增加培养表面积，适合实验室研发或小批量疫苗生产（如早期临床试验用疫苗），但规模化能力有限，工业生产中多作为种子细胞扩增设备。

（3）一次性生物反应器（SUB）的特殊价值

在病毒疫苗生产中，SUB 的应用日益广泛，尤其适用于以下场景：

紧急疫苗生产：如新冠疫情期间，SUB 可快速搭建生产流程，无需清洁灭菌，缩短生产周期（从传统反应器的数周缩短至数天），满足应急供应需求。

多品种疫苗生产：SUB 可快速切换生产规模或产品类型，且无交叉污染风险，适合同时生产多种疫苗（如流感、狂犬病疫苗）的企业。

小规模研发与中试：SUB 体积灵活（从毫升级到数百升），可用于疫苗工艺开发阶段的参数优化，降低研发成本。

表 2：不同类型生物反应器的优势与适用疫苗类型

2.2 生物反应器选型的核心决策因素

疫苗类型：灭活疫苗需大量病毒颗粒，优先选择高细胞密度培养的反应器（如固定床、搅拌罐）；载体疫苗（如腺病毒载体）需避免载体复制过程中的污染，优先选择 SUB；病毒样颗粒疫苗需维持颗粒结构稳定，优先选择低剪切力反应器（如气升式、波浪式）。

生产规模：实验室研发或小批量生产（如早期临床试验）适合波浪式、小型搅拌罐反应器；大规模生产（如千万剂级疫苗）适合大型搅拌罐、固定床反应器。

细胞特性：对剪切力敏感的细胞（如昆虫细胞）避免选择高搅拌速度的 STR；贴壁细胞需选择提供附着表面的反应器（如固定床、中空纤维）。

成本与效率：SUB 前期投入低但耗材成本高，适合多品种、小批量生产；传统不锈钢反应器前期投入高但长期成本低，适合单一品种、大规模生产。

三、生物反应器操作模式优化：提升病毒产量的 “关键策略”

生物反应器的操作模式直接影响细胞生长与病毒复制效率，目前主流的操作模式包括批次培养、补料分批培养、 perfusion 培养，各有适用场景，需结合疫苗生产需求选择或组合使用。

3.1 批次培养（Batch Culture）

批次培养是最基础的操作模式：将细胞与培养基一次性加入反应器，培养过程中不添加营养、不移除产物，待细胞生长至目标密度、病毒复制完成后，一次性收获。

优势：操作简单、污染风险低、易于控制，适合实验室研发或小规模生产（如早期疫苗工艺验证）。

局限性：营养消耗快，细胞生长后期易因营养不足或废物（如乳酸、氨）积累进入稳定期，病毒产量受限；无法实现高细胞密度培养。

应用场景：病毒疫苗研发阶段的工艺探索，或生产周期短、产量需求低的疫苗（如某些小众病毒疫苗）。

3.2 补料分批培养（Fed-Batch Culture）

补料分批培养在批次培养基础上，根据细胞生长需求，阶段性补充营养（如葡萄糖、氨基酸），维持培养基中营养浓度在适宜范围，同时不移除产物。

优势：延长细胞对数生长期，实现更高细胞密度（较批次培养提升 2-3 倍）；减少代谢废物积累，维持细胞活性，进而提升病毒产量；操作难度适中，适合中大规模疫苗生产。

关键优化点：补料时机与补料量需精准控制 —— 过早补料易导致营养过剩，浪费资源；过晚补料易导致细胞生长停滞。通常通过在线传感器监测葡萄糖、乳酸浓度，触发补料程序。

应用场景：流感疫苗、新冠灭活疫苗生产中广泛应用。例如，某企业生产流感疫苗时，采用补料分批模式，分 3-4 次补充葡萄糖和谷氨酰胺，细胞密度提升至 5×10⁶ cells/mL，病毒滴度较批次培养提升 1.5 倍。

3.3 灌注培养（Perfusion Culture）

灌注培养是更先进的操作模式：通过细胞截留装置（如中空纤维过滤器、倾斜沉降器），在培养过程中持续添加新鲜培养基，同时持续移除含废物的培养液和产物（如病毒颗粒），细胞则保留在反应器内继续生长。

优势：实现长期高细胞密度培养（细胞密度可达 10⁷-10⁸ cells/mL），病毒产量大幅提升（较补料分批提升 3-5 倍）；持续移除废物，避免产物抑制；可实现病毒的连续收获，适合需要大量病毒的疫苗生产。

关键技术：细胞截留装置是核心 —— 需高效保留细胞，同时避免堵塞。目前常用的有交替式切线流过滤（ATF）和切线流过滤（TFF），其中 ATF 通过 diaphragm 泵实现培养液循环，剪切力低，适合对剪切敏感的细胞（如 Vero 细胞）。

应用场景：新冠 mRNA 疫苗、腺病毒载体疫苗大规模生产。例如，某公司利用 ATF 灌注系统的搅拌罐生物反应器生产新冠 mRNA 疫苗，细胞密度维持在 1×10⁷ cells/mL 以上，连续收获 7-10 天，病毒 RNA 产量较补料分批提升 4 倍。

图 1：生物反应器三种操作模式对比示意图

3.4 操作模式的组合应用

实际疫苗生产中，常结合多种操作模式优化流程。例如，流感疫苗生产可采用 “种子扩增阶段（批次培养）→ 大规模细胞培养（补料分批培养）→ 病毒复制与收获（灌注培养）” 的组合模式：

种子扩增阶段：用小体积批次培养扩增种子细胞，快速获得足量接种细胞；

大规模细胞培养阶段：用补料分批培养提升细胞密度，为病毒复制奠定基础；

病毒复制阶段：切换为灌注培养，持续补充营养、收获病毒，提升产量。

四、生物反应器关键参数控制：保障病毒疫苗质量的 “核心防线”

病毒疫苗的质量与安全性高度依赖生物反应器的参数控制，需实时监测并精准调节物理参数（温度、pH、搅拌速度）、化学参数（溶解氧、营养浓度、废物浓度）和生物参数（细胞密度、细胞活力），确保细胞稳定生长与病毒高效复制。

4.1 物理参数控制（1）温度

不同细胞的最适生长温度不同：哺乳动物细胞（如 Vero、CHO 细胞）最适温度为 37℃；昆虫细胞（如 Sf9 细胞）最适温度为 27-28℃；病毒复制阶段的温度可能需调整（如流感病毒复制最适温度为 33-35℃）。

控制方式：生物反应器通过夹套或水浴加热 / 冷却，配合温度传感器实时监测，精度控制在 ±0.1℃。

关键影响：温度过高会导致细胞蛋白质变性、死亡；温度过低会抑制细胞代谢，减缓生长与病毒复制。例如，新冠病毒复制对温度敏感，37℃下病毒滴度较 33℃低 20%-30%，因此生产中需在病毒接种后将温度下调至 33℃。

（2）pH 值

哺乳动物细胞最适 pH 为 7.2-7.4，昆虫细胞为 6.2-6.8。pH 值影响细胞酶活性、细胞膜通透性，进而影响营养吸收与病毒复制。

控制方式：通过添加酸（如 HCl）或碱（如 NaOH、NaHCO₃）调节，同时利用 CO₂通气辅助稳定 pH（CO₂溶解后形成 H₂CO₃/HCO₃⁻缓冲对）。

关键影响：pH 过高（>7.6）会导致氨中毒；pH 过低（<7.0）会抑制细胞呼吸链功能。例如，Vero 细胞培养中，pH 低于 7.0 时，乳酸生成量增加，细胞活力下降，病毒产量降低 15%-20%。

（3）搅拌速度

搅拌速度影响培养基混合均匀性与氧气传递效率，需平衡 “混合效果” 与 “剪切力损伤”：

悬浮细胞：搅拌速度通常为 50-150 rpm，如 MDCK 细胞搅拌速度控制在 80-100 rpm，既保证混合均匀，又避免剪切力损伤细胞。

贴壁细胞（微载体培养）：搅拌速度需更低（30-80 rpm），防止微载体碰撞破碎，如 Vero 细胞微载体培养中，搅拌速度控制在 50 rpm 左右。

4.2 化学参数控制（1）溶解氧（DO）

细胞有氧呼吸需氧气，溶解氧是细胞生长与病毒复制的关键参数：哺乳动物细胞最适 DO 为 30%-50% 空气饱和度；病毒复制阶段 DO 需求可能更高（如流感病毒复制需 DO>40%）。

控制方式：通过通气系统（如多孔曝气石）通入空气或纯氧，配合搅拌提升氧气传递效率；DO 传感器实时监测，低于设定值时自动增加通气量。

关键影响：DO 过低（<20%）会导致细胞无氧呼吸，产生大量乳酸，抑制生长；DO 过高（>80%）可能产生氧自由基，损伤细胞与病毒。

（2）营养浓度

核心营养包括葡萄糖、氨基酸、谷氨酰胺，需维持在适宜范围：

葡萄糖：浓度控制在 2-5 g/L，过低导致能量不足，过高导致乳酸积累；可通过补料系统阶段性补充，或采用 perfusion 系统持续供给。

谷氨酰胺：细胞合成蛋白质的关键氨基酸，浓度控制在 0.5-2 mmol/L，过低会抑制细胞生长，过高会导致氨积累（谷氨酰胺分解产生氨）。

（3）废物浓度

主要废物包括乳酸（葡萄糖代谢产物）和氨（氨基酸分解产物），需控制在安全范围：

乳酸：浓度 < 2 g/L，过高会降低培养基 pH，抑制细胞代谢；可通过控制葡萄糖供给（如补料分批）或 perfusion 系统移除。

氨：浓度 < 2 mmol/L，过高会破坏细胞膜完整性；可通过选择低氨生成的氨基酸类似物（如谷氨酰胺替代物）或 perfusion 系统移除。

4.3 生物参数监测（1）细胞密度与活力

细胞密度：通过细胞计数仪（如台盼蓝染色法）或在线传感器（如电容传感器）监测，反映细胞生长状态，是判断 “何时接种病毒” 的关键依据 —— 通常在细胞进入对数生长期后期（如 Vero 细胞密度达 2×10⁶ cells/mL）接种病毒，此时细胞代谢活跃，能高效支持病毒复制。

细胞活力：通过台盼蓝排斥法或荧光染色法监测，活力 > 90% 为正常，<80% 需调整培养条件（如补充营养、降低温度），否则会影响病毒产量。

（2）病毒滴度

通过蚀斑实验、TCID₅₀（50% 组织培养感染剂量）等方法监测，反映病毒复制效率，是判断 “何时收获病毒” 的核心依据 —— 通常在病毒滴度达到峰值（如流感病毒滴度达 10⁸ TCID₅₀/mL）时收获，避免后期病毒颗粒降解。

五、疫苗生产全流程质量控制：从反应器到成品的 “安全保障”

病毒疫苗的质量与安全性是生产的核心目标，需贯穿从生物反应器操作到成品灌装的全流程，核心包括污染控制、产物纯化、质量检测三大环节。

5.1 污染控制：避免外源微生物混入

污染是疫苗生产的重大风险，可能导致批次报废，需从源头防控：

无菌操作：生物反应器需具备完善的无菌系统（如蒸汽灭菌、在线灭菌）；操作人员需严格遵守无菌规程（如穿戴无菌防护服、使用无菌耗材）；一次性生物反应器（SUB）因使用后丢弃，可彻底避免交叉污染。

环境控制：生产车间需划分洁净区（如 A 级：灌装区；B 级：反应器操作区），通过空气过滤（HEPA 过滤器）、正压通风控制环境微生物数量。

原料质控：培养基、血清、细胞种子需经过严格检测，确保无外源病毒（如支原体、逆转录病毒）、细菌、真菌污染。

5.2 产物纯化：去除杂质，保留有效抗原

从生物反应器收获的培养物含细胞碎片、杂质蛋白、核酸等，需通过多步纯化工艺获得纯病毒或抗原：

澄清：通过离心、深度过滤去除细胞碎片和大颗粒杂质；

纯化：通过层析（如离子交换层析、凝胶过滤层析）去除杂质蛋白、核酸；

浓缩：通过超滤浓缩病毒或抗原，提高浓度；

灭活（针对灭活疫苗）：通过甲醛、β- 丙内酯等化学试剂灭活病毒，确保无感染性，同时保留抗原性。

例如，新冠灭活疫苗纯化中，采用 “离心 + 深层过滤 + 离子交换层析 + 超滤浓缩” 的流程，纯度可达 95% 以上，杂质蛋白含量 < 0.1%。

5.3 质量检测：确保每一批次疫苗合格

疫苗成品需通过严格检测，符合国家或国际标准（如 WHO 标准），核心检测项目包括：

纯度：检测杂质蛋白、核酸含量，确保无外源污染物；

效价：检测抗原含量与免疫原性（如通过 ELISA 检测抗原浓度，动物实验验证免疫保护效果）；

安全性：检测无菌性、无热原性（如鲎试剂法检测内毒素）、无外源病毒；

稳定性：通过加速稳定性实验（如 37℃放置 2 周）验证疫苗在储存期内的质量稳定性。

六、总结

生物反应器是病毒疫苗生产的 “核心装备”，其选型、操作模式与参数控制，直接决定疫苗的产量、质量与安全性。在实际生产中，需以 “细胞特性 - 病毒需求 - 生产规模” 为导向，选择匹配的生物反应器类型，优化操作模式（如补料分批结合 perfusion），并通过精准控制温度、pH、溶解氧等参数，为细胞生长与病毒复制创造最佳环境。同时，全流程的质量控制（污染防控、产物纯化、质量检测）是疫苗安全的 “最后防线”，需贯穿生产始终。随着生物技术的发展，生物反应器将朝着更智能化（如 AI 参数优化）、更可持续（如循环经济设计）的方向演进，为病毒疫苗的高效、安全生产提供更强支撑。

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