《食品科学》：福建水产研究所刘智禹教授级高级工程师等：河鲀鱼皮源促胆囊收缩素分泌肽的制备及结构鉴定

肥胖已成为危害居民健康的严重公共卫生问题，如何控制肥胖的发生发展受到广泛关注。胆囊收缩素（CCK）是由肠内分泌细胞分泌的一种肠道激素，可通过激活外周神经元和神经中枢增强机体饱腹感并抑制食欲。CCK的分泌受饮食因素调控，寻找刺激细胞分泌CCK的生物活性物质将对控制肥胖及其相关慢性疾病的发展具有重要意义。现有研究表明，膳食蛋白质源的消化/酶解产物或活性肽是诱导CCK分泌的潜在刺激物，小麦、荞麦和大麦的蛋白质水解物能够显著促进肠道CCK的分泌，但关于其他食品蛋白来源水解物或活性肽的促CCK分泌活性研究仍然有限。因此，寻找和研究其他来源具有促CCK分泌活性的食物蛋白源活性肽，对于控制肥胖及其相关慢性疾病具有重要意义。

胶原蛋白是河鲀鱼皮、鱼骨等部位的主要成分。鱼皮中的胶原蛋白占鱼皮干质量的80%以上，是生产制备胶原蛋白肽的优质原料。开展河鲀鱼皮胶原蛋白肽的促CCK分泌活性研究，不仅有助于开发相关功能性食品配料，还能增加河鲀鱼的附加值。

上海理工大学健康科学与工程学院的宋洪东、任韶霞，福建水产研究所的刘智禹*等以河鲀鱼皮为原料提取胶原蛋白，通过酶解方法获得胶原肽，采用体外模型评价不同水解度胶原肽的促CCK分泌活性，最后分离纯化和鉴定具有促CCK分泌活性的肽段，以期为河鲀鱼皮肽新型功能产品开发提供理论依据。

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河鲀鱼皮源促胆囊收缩素分泌肽的制备及结构鉴定

采用碱性蛋白酶酶解的方法制备河鲀鱼皮肽，水解度随时间的变化情况如图1所示。水解度随水解时间的延长而增加，特别是在前60 min，水解度增加迅速；之后随时间的延长水解度增加缓慢，180 min后水解度趋于稳定。碱性蛋白酶具有广泛的酶切位点，可作用于河鲀鱼皮胶原蛋白将其分解成分子质量较小的肽。河鲀鱼皮胶原蛋白经过15、30、45、60、120、180 min和240 min水解后，最终水解度分别为8.42%、10.74%、12.04%、13.38%、16.28%、18.30%和18.50%。胶原蛋白不易被胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、无花果蛋白酶、木瓜蛋白酶等水解，而碱性蛋白酶能较好地水解河鲀鱼皮胶原蛋白，适合制备低分子质量的胶原肽。

进一步采用SDS-PAGE法表征河鲀鱼皮胶原蛋白在水解过程中的结构变化，结果如图2所示。河鲀鱼胶原蛋白主要由2 条

在SDS-PAGE分析中，利用考马斯亮蓝G250法检测蛋白质和多肽条带存在局限性，它仅能够检测3 000 Da以上的蛋白质或多肽。因此，本实验利用尺寸排阻色谱技术进一步表征酶解物（胶原肽）的分子质量分布。该技术基于分子的大小或流体动力学体积与色谱填料中孔隙平均直径之间的相对关系，小分子肽在色谱柱填料孔隙中停留时间较长，因此较晚被洗脱出来；反之，大分子肽由于避开了这些孔隙，因此会更早地从色谱柱中洗脱出来。如图3所示，AP-6中75%以上肽的分子质量小于3 000 Da，其中42%的肽分子质量小于1 000 Da。AP-12中超过90%的肽分子质量小于3 000 Da，其中小于1 000 Da的肽占比超过60%。AP-18中几乎所有肽的分子质量均小于3 000 Da，其中83%以上的肽分子质量小于1 000 Da。不同来源蛋白质和水解程度会显著影响蛋白质水解物或肽的促CCK分泌活性，因此，进一步评价了这3种不同水解度胶原肽的促CCK分泌活性。

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不同水解度河鲀鱼皮胶原肽的促CCK分泌活性

STC-1细胞系最初来源于小鼠肠内分泌肿瘤细胞，具有肠道天然肠内分泌细胞的许多特征，它能够分泌多种肠道激素，如CCK、胰高血糖素样肽-1、抑胃肽和肽YY，从而响应胃肠道的刺激。因此，STC-1细胞系作为体外模型已被广泛用于研究食物成分对肠道激素分泌的影响。3种不同水解度的胶原肽对STC-1细胞CCK分泌的影响结果如图4所示。与对照组相比，AP-6和AP-12有显著的促CCK分泌活性，其中AP-12的促CCK分泌活性最强。然而，随着水解度的进一步提高，AP-18没有表现出显著的促CCK分泌活性。水解度影响肽的分子质量及氨基酸序列。而肽的分子质量和氨基酸序列会极大影响其促CCK分泌活性。例如，Tulipano等指出，在刺激CCK分泌方面肽长度比氨基酸序列起着更重要的作用，因为只有含有5 个或更多氨基酸的肽才能增强CCK分泌，而二肽和三肽没有这种活性。同样地，Caron等报道了分子质量为400～700 Da的肽和肽序列中具有高比例的芳香族氨基酸，其对CCK分泌具有很强的刺激活性。Santos-Hernández等则发现，从蛋清胃肠道消化产物中鉴定出的CCK释放肽长度少于10 个氨基酸。Huang Kai等研究发现，具有CCK促分泌活性的肽序列长度为4 个或6 个氨基酸。以上结果表明合适的水解度对于保证河鲀鱼皮胶原肽的促CCK分泌活性非常重要。

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河鲀鱼皮胶原肽的分离纯化

鉴于AP-12具有最强的促CCK分泌活性，因此利用C18色谱柱进一步将其分离纯化，以寻找目标肽段。如图5所示，河鲀鱼皮蛋白肽AP-12被分离成3 个不同疏水性的组分（F1、F2、F3）。基于C18色谱柱根据亲疏水性分离不同组分的原理，可知它们的疏水能力大小为F3＞F2＞F1。在此基础上进一步评价这3 个组分对STC-1细胞CCK分泌的影响。首先考察了这3 个组分（5 mg/mL）的细胞毒性，结果如图6A所示。F1、F2、F3组分对细胞活力没有显著影响，进而评价了这3 个组分的促CCK分泌活性，结果如图6B所示。与对照组相比，3 个组分均可显著刺激CCK的分泌，其中疏水性最强的组分F3具有最强的促CCK分泌活性。因此，选择F3组分进行LC-MS/MS分析以鉴定促CCK肽的序列。

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河鲀鱼皮促CCK分泌肽的鉴定

尽管肽和游离氨基酸都能促进哺乳动物CCK的分泌，但最新研究显示，肽比游离氨基酸具有更强的促CCK分泌活性。因此，鉴定具有促CCK分泌活性的肽序列至关重要。这些活性肽的结构特征决定了它们是否能够在体内外发挥生理作用。研究肽结构与促CCK分泌活性的关系，有助于阐明它们如何与肠内分泌细胞相互作用而影响CCK分泌。不同食品蛋白质经酶解或消化后，可产生多种结构特征的肽，对CCK分泌的影响各异。根据主要离子的MS/MS数据进行手动计算和数据库匹配分析，成功鉴定出6 条肽序列，包括EGPK、LSGK、LQGPIGL、LPGKPGL、KMTPT和FQEVAVV。鉴定的肽序列通过ProteinProspector工具（https://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm）进行验证。首先评价了这些肽在5 mmol/L条件下对细胞活力的影响，结果如图7A所示。在此浓度条件下6 条肽对STC-1细胞均无毒性。进一步评价了这6 条肽对STC-1细胞分泌CCK的影响，结果如图7B所示。在0～5 mmol/L浓度范围内，LSGK、LPGKPGL和KMTPT具有显著的促CCK分泌活性，其中LSGK具有最强的促CCK分泌效果，且作用效果呈现剂量依赖性。本研究鉴定的肽可通过化学合成获得，亦可通过酶解和纯化河鲀鱼皮胶原蛋白获得。化学合成的纯肽产品在食品领域尚未见批准使用。而经食品蛋白酶解和纯化获得的肽可作为配料在食品领域使用。本研究阐明了河鲀鱼皮中发挥促CCK分泌活性的肽序列，可为河鲀鱼皮源促CCK分泌肽的制备和生产提供理论指导。

肽的序列长度、氨基酸组成等显著影响其促CCK分泌活性。Santos-Hernández等发现，短于10 个氨基酸的肽能刺激CCK分泌；Caron等也报道分子质量在400～700 Da的肽对CCK分泌有显著刺激作用，本研究结果与上述报道相似。本研究鉴定的3 条促CCK分泌肽含有的氨基酸数量分别为4、5 个和7 个，且分子质量均在400～700 Da之间。这些研究表明适当的肽长度或分子质量可能是肽发挥促CCK分泌活性的关键因素。

特定的氨基酸组成也可能是影响肽发挥促CCK分泌活性的原因之一。本课题组前期研究发现，小麦肽RYIVPL以及荞麦肽PAFKEEHL和RVTVQPDS呈现显著的促CCK分泌活性，这些肽富含带电和疏水性氨基酸。Santos-Hernández等指出，特定的氨基酸如R、V、P和L可能使肽更容易与肠内分泌细胞的营养感应受体结合。肽与感应受体活性口袋的结合可能受其分子大小、带电荷的氨基酸和疏水性影响。未来还需鉴定更多具有促CCK分泌活性肽，并进一步研究肽结构与促CCK分泌活性之间的关系。

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结 论

本研究探讨了河鲀鱼皮胶原肽对肠道内分泌细胞CCK分泌的影响，利用碱性蛋白酶水解河鲀鱼皮胶原蛋白且水解度为12%时获得的肽产物具有最强的促CCK分泌活性。该产物中超过90%肽的分子质量小于3 000 Da，其中小于1 000 Da的肽占比超过60%。进一步利用C18色谱柱对胶原肽进行分离纯化，并结合LC-MS/MS技术，成功鉴定出3 条具有促CCK分泌活性的肽序列，包括LSGK、LPGKPGL和KMTPT。本研究可为河鲀鱼皮肽在调控肠道CCK分泌方面的应用提供理论支撑，但促CCK分泌肽的构效关系尚需深入研究。

本文《河鲀鱼皮源促胆囊收缩素分泌肽的制备及结构鉴定》来源于《食品科学》2025年46卷第12期156-162页，作者：宋洪东，任韶霞，邵诸伟，葛少成，乔 琨，刘智禹*。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20241111-075。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑：梁雯菁；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

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