上海交大团队AI驱动酶进化，琥珀酸产量提升1000倍

在传统化工领域，琥珀酸是一种重要的生物基平台化学品，可广泛用于生物可降解塑料、溶剂、药物及食品添加剂等领域。过去，工业界主要依赖石油化工路线来生产琥珀酸，但这种方式成本高、能耗大、污染严重，与当下的绿色发展目标格格不入。因此，科学家们一直尝试利用微生物发酵来替代石化路径。然而，如何在保证高产量和低成本的同时减少副产物并提高代谢效率，一直是困扰该领域的关键难题。

近日，上海交通大学赵心清研究团队发表于 Chemical Engineering Journal 期刊的一篇题为“Establishment of succinic acid production in recombinant Kluyveromyces marxianus enhanced by AI-guided enzyme specificity engineering and redox-controlled fermentation optimization”的研究中，研究人员提出了一种名为 EKAD 的人工智能驱动酶定向进化策略，成功改造了富马酸水合酶（FHase）的催化特异性，显著提升了琥珀酸的合成效率，并通过结合代谢工程改造和发酵工艺优化，首次在马克斯克鲁维酵母这一具有应用潜力的非传统酵母中建立起高效的琥珀酸生产体系，使产量比野生型菌株提升了一千倍以上。

过去，马克斯克鲁维酵母并非常见的琥珀酸生产菌株，但它具备明显优势：生长速度快、能耐较高温度、可以利用多种廉价碳源，而且在食品工业中被认为是安全（GRAS）菌株，非常适合工业规模的应用。

图 | 研究人员在细胞内重构了还原型三羧酸循环（rTCA）通路

为了发挥这些优势，研究团队首先需要提高该菌株的基因编辑效率，将编码酿酒酵母 DNA 修复和重组蛋白的 scRAD52 插入 KU70 基因座，获得工程菌株 K. marxianus NBKD 同源重组效率从不到 10% 提升到 90% 以上，为后续代谢通路的构建和优化打下了基础。

在此基础上，研究人员进一步重构了还原型三羧酸循环（rTCA）通路，这是合成琥珀酸的一条高理论得率路径。通过调整关键酶的位置和基因剂量，他们减少了中间代谢物的堆积，并额外引入来自大肠杆菌的可溶性跨氢酶（SthA），帮助调节 NADH/NAD⁺ 平衡，确保还原力充足供应琥珀酸合成。经过这一系列代谢工程改造，改造菌株在摇瓶水平的 SA 产量已明显提升。

在整个改造过程中，一个核心的突破来自研究人员利用人工智能对酶进行定向设计，从而有效攻克了合成路径中的关键瓶颈——“逆反应”。细胞代谢网络中的许多关键酶具有可逆性，这种生理特征有助于维持稳态，却在工业生产中引发副产物堆积并降低得率。本研究关注的富马酸水合酶（fumarate hydratase, FHase）就是典型例子：它既能催化苹果酸（MA）转化为富马酸（FA），也能进行逆反应，导致苹果酸积累，限制琥珀酸合成效率。

为解决这一瓶颈，团队开发了一种名为 EKAD 的人工智能方法，其整合了蛋白语言模型 ESM-2、催化速率常数预测模型 DLKcat、AlphaFold2 蛋白结构预测和分子对接计算，能够从序列到结构多层次分析突变对酶活性和底物亲和力的影响，令研究人员能够在计算机中高效筛选出最有潜力的突变，从而避免大量耗时耗力的随机突变与实验筛选。

利用该方法，研究人员仅通过一轮 EKAD，就鉴定出 FHase 的一个单一突变 (V365E)，将第 365 位氨基酸由缬氨酸替换为谷氨酸，该突变对 SA 合成表现出更高的特异性。

图 | 利用 EKAD 方法筛选出的突变显著增强了 MA 到 FA 的反应活性并抑制了逆反应

实验结果显示，这一单点突变能够明显增强苹果酸向富马酸转化的效率，同时显著抑制逆反应，使琥珀酸合成效率提高了 30% 以上，而副产物苹果酸减少了近 70%。

随后，在实验室小规模验证成功后，研究人员把突变酶导入到工程菌株中，并在 3 L 发酵罐中测试。结果令人振奋：在 37 °C 下培养 96 小时后，重组 K. marxianus 的 SA 产量达到 103.9 g/L，是野生型的千倍以上，得率为 0.51 g/g，首次在该菌株中实现了高水平生产。

图 | 改造突变菌株 Z6 与野生菌株 Z5 在 3L 生物反应器中琥珀酸生产性能对比

不仅如此，研究人员还利用转录组和代谢组的联合分析，揭示了这一突变的全局性影响，结果表明改造后的的菌株在能量代谢、氨基酸代谢和转运系统等多个方面均发生了显著变化，说明 AI 定向设计的效果并不仅限于单一酶，而是通过复杂的代谢网络级联，推动了整体生产性能的提升。

总之，这项研究在应用上为琥珀酸的绿色可持续生产提供了全新路径。相比传统石化方式，利用改造酵母发酵不仅环保，还具备可再生性，且产量与效率已经接近甚至达到工业需求。此外，在方法学上，它展示了一种普适的思路：通过 AI 驱动的酶定向进化来解决代谢通路中的可逆性问题，从而减少副产物堆积并提升目标产物得率。

未来，这一策略未来有望推广到氨基酸、醇类甚至药物前体等多种化合物的合成，极大拓展合成生物学的应用边界。

参考文献：

1.https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S1385894725090527

免责声明：本文旨在传递合成生物学最新讯息，不代表平台立场，不构成任何投资意见和建议，以官方/公司公告为准。本文也不是治疗方案推荐，如需获得治疗方案指导，请前往正规医院就诊。