浙江
师弟
马上就十一假期了，好想休息，但是导师说假期必须把组化数据搞定。
好办呀，提前花两天时间集中肝一下实验，一边放假一边统计数据。
师兄
师弟
不行啊师兄！我有 5 个目标蛋白，至少还要做 5 次实验！
那你试试多重荧光免疫组化吧，单次实验即可完成 7 色 + 多维空间表型分析，还能得到比常规组化更精准的高信噪比数据呢！
师兄
师弟
哇，这意味着我仅需做 1 张切片，即可实现多靶点空间定位分析，这个实验结果一定更有说服力！这样我岂不是能放 8 天假！
表 1. 空间蛋白组学常见研究方法分析
是啊，多重荧光免疫组化可突破抗体物种限制，一次检测多个目标靶点（点击免费试用诺唯赞多色免疫组化检测试剂盒）。接下来我们一起来看看多重荧光免疫组化的原理和优势。
师兄
多重荧光免疫组化 5 大应用领域与常见问题
Q：多重荧光免疫组化的原理是什么？
A：多重荧光免疫组化是利用酪胺信号放大技术（Tyramide Signal Amplification，TSA）对信号进行放大标记，酪胺标记的荧光素在辣根过氧化物酶（HRP）和过氧化氢作用下被活化，并被催化与周围蛋白残基共价偶联，在抗原－抗体结合部位形成大量的荧光素沉积，实现组织或细胞单个样本的原位染色，通过多轮「染色 - 洗脱」循环，可在 1 张组织切片上检测 3～6 种靶点，并实现亚细胞级空间互作解析，是一种高维蛋白空间定位方法。
图 1. 多重荧光免疫组化原理展示
Q：多重荧光免疫组化可以解决哪些难题？
A：相较于传统 IHC 和 IF 方法，该技术不受一抗种属选择的限制，成倍提高低丰度靶标的染色信号，可实现更多重靶标染色。结合高通量成像与深度数据分析，能够揭示细胞间的相互作用以及分子水平上的空间模式。利用分析与交互式数据验证，生成可视化图表，提升科研结果的准确性与学术影响力，广泛应用于以下研究领域：
图 2. 多重荧光免疫组化应用领域
Q：多重荧光免疫组化的实验流程包括哪些？
图 3. 多重荧光免疫组化实验流程图
Q：实验过程中有哪些常见问题？如何解决？
表 2. 多重荧光免疫组常见操作问题及解决方案
一图了解诺唯赞多色免疫组化产品
Vazyme 推出的多色免疫组化检测试剂盒在测试中表现优秀。该试剂盒的核心优势体现在三个方面：首先是信号放大能力，它能够实现成倍的信号放大，使得检测结果更为清晰；其次是染料特异性，它能够在多种荧光同时检测的情况下不发生串色，有效减少背景干扰；最后是荧光抗淬灭特性，确保荧光染料具有更好的稳定性。
多重荧光免疫组化，让十一假期休息也变成可能！
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图 4. 多色免疫组化检测试剂盒产品展示图
接下来，通过一个应用案例，展示 Vazyme 多色免疫组化试剂盒在分析人扁桃体免疫微环境中的实际应用。该实验利用共定位技术，揭示了免疫细胞的功能亚群和协作模式，为研究免疫微环境提供了新的见解。
Vazyme 多色免疫组化检测试剂盒扁桃体组织染色结果图证明了试剂盒在实际应用中的高效性，也展示了其在解析复杂生物样本时的可靠性。
图 5. Vazyme 多色免疫组化检测试剂盒扁桃体组织染色结果图
实验结论：
①区域免疫功能分工：在扁桃体的固有层中，CD69+、CD4+、CD69+CD4+（双阳）细胞阳性率均显著高于上皮层。说明扁桃体上皮层与固有层存在明确的免疫功能分工。
②免疫细胞协作机制：在扁桃体的固有层中，组织驻留性 T 细胞（TRM，CD8+CD103+）细胞周围的 CD4+ 细胞数量显著高于上皮层，并呈现出距离 TRM 细胞越远，CD4+ 细胞越多的趋势，即在黏膜免疫的细胞协作中，近距离 CD4+ 细胞辅助可保证 TRM 能快速清除局部威胁，而远处 CD4+细胞完成抗体生成、免疫调节等更广泛的功能。
③活化信号的梯度扩散：淋巴滤泡外围扩散区域（0-10-20-30μm）内，CD69+/CD4+CD69+ 细胞的阳性率呈现出距离淋巴滤泡越远越少的趋势。说明淋巴滤泡是局部免疫活化的「信号源」，其释放的活化信号呈浓度梯度扩散。
④滤泡间 T 细胞的空间协作：相对于间质区，在滤泡间区，CD4+ 辅助 T 细胞与 CD8+ 细胞毒性 T 细胞距离更近。说明淋巴滤泡作为适应性免疫应答的「核心执行区」，通过缩短 CD4+ 与 CD8+ 细胞的距离，最大化二者的协作效率、加速免疫应答启动，并兼顾免疫稳态调控。
该试剂应用的其他数据统计分析图：
图 6. 组织区域识别图
图 7. 扁桃体上皮层 - 扁桃体固有层识别图
图 8. 扁桃体淋巴滤泡识别图
图 9. 单细胞水平分析 —— 细胞核识别
图 10. 有效细胞核识别图
图 11. 单细胞水平分析 —— 单阳性细胞识别图
图 12. 单细胞水平分析 —— 双阳性细胞识别图
图 13. 细胞表型鉴定图
图 14. 原位模式图
图 15. 单通道平均荧光强度分析图
图 16. 细胞表型：阳性率 / 阳性细胞密度分析图
图 17. Lamina propria-Epithelial layer：邻域细胞计数
图 18. 组织 - 细胞：分区阳性细胞计数分析图
图 19. 组织 - 细胞：分区邻域细胞间距离
图 20. 数据交互式验证与探索
（A）原位模式图；（B）交互分析表；（C）单细胞画廊；（D）可视化原位阳性细胞
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内容策划：沈佳钰
内容审核：吴军
题图来源：图虫创意
文中图片来源：诺唯赞
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