《食品科学》：兰州理工大学任海伟教授等：6 株野生羊肚菌的分子鉴定及高活力菌株筛选

羊肚菌是一种珍贵的食药两用真菌，属于子囊菌门、盘菌纲、盘菌目、羊肚菌科，属低温型菌，喜阴怕阳，适宜在土壤湿润的环境中生长。目前，羊肚菌的栽培方法主要有固体栽培和液体栽培，二者区别在于接种的菌种状态不同。固体栽培方法简便易行，但菌种培养耗时长、纯度低，容易导致产量不稳定；液体菌种栽培则具有培养周期短、播种方便、成本低、出菇均匀等优势，但需要生长速度快、产量高、抗病虫害能力和适应性强的高质量菌种，且对技术和设施条件要求较高。因此，筛选优质高产菌株对提高羊肚菌液体栽培出菇率和高产稳产至关重要。

兰州理工大学生命科学与工程学院的向雨萌、吴琦、任海伟*等将收集的6 株野生羊肚菌作为研究对象，首先通过形态学观察和分子生物学手段对其进行鉴定，再对羊肚菌交配型基因MAT1-1和MAT1-2的表达情况进行分析。在此基础上，将含有MAT1-1及MAT1-2基因的菌株进行液体发酵培养，通过测定其抗氧化酶活力和丙二醛（MDA）含量等筛选能出菇且菌丝活力强的优良菌株，以期为羊肚菌液体栽培技术推广提供依据。

01

6 株羊肚菌的菌丝体形态学观察

如图1平板观察结果所示，6 株野生羊肚菌的菌丝排列紧密，末端细胞不断分枝，膨大与交织，壁厚增加，并分泌色素，形成白色或棕褐色颗粒状菌核。显微镜观察发现，羊肚菌菌丝是无色的细长丝状结构，菌丝排列紧密，且呈多级分枝特征，菌丝末端较钝，分枝越多尖端菌丝越细。进一步通过SEM观察，LM1、LM4菌丝较粗壮，LM6菌丝较细，LM2、LM3、LM5菌丝粗细不均且表面均分布有球状体。说明LM2、LM3、LM5气生菌丝竹节状，LM1、LM4、LM6气生菌丝桥连状。

由表2可知，LM2菌株生长速度最快，为0.45 mm/d，菌丝由初期微白变为后期黄色；LM6菌株的菌丝生长速度最慢，为0.4 mm/d，其菌丝由初期淡黄色逐渐变为褐色；其余4 株的生长速度差异不明显，且菌丝均由初期白色变为后期微黄色。

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分子鉴定

2.1 ITS单基因测序

首先对ITS序列进行处理，去除引物序列，再利用NCBI数据库中BLAST程序进行同源比对，下载相似度高的序列，应用MEGA6.0软件通过邻接法构建系统发育树。由图2可知，6 株野生羊肚菌与NCBI库中基因编号为MG589676、MH100894、MG431334的羊肚菌相似度达100%，并且和黑色羊肚菌系列的OQ691651位于同一分支上，说明6 株野生羊肚菌均属于六妹羊肚菌（M. sextelata）。

2.2 多基因联合测序

在NCBI库中检索M. esculenta的RPB1、RPB2、EF-1α、ITS rDNA、LSU rDNA 5 个基因序列，登录号分别是MZ754070、OL423318、OQ944470、OQ944471和OQ944472。用BioEdit进行比对和剪切，去除低质量序列，然后用PhyloSuite进行基因合并，合并顺序为28s-ef-its-rpb1-rpb2，序列长度为3 887 bp，使用iqtree测试TNe+R2最佳模型，设置1 000万 次重复，并以YAASMVR作为外群运行数据，结果显示支持率超过75%。由图3可知，6 株野生羊肚菌与M. sextelata/YAASM84、M. sextelata/YAASMHL聚类在一个分支，支长差异极小，这与图2中ITS序列建树结果一致，再次证明属于六妹羊肚菌（M. sextelata）。

03

交配型基因

子实体的形成与生长发育不仅需要一定的环境和营养条件，还与其特有遗传因子有关。真菌的有性发育是由一个名为交配型MAT基因座的基因协调的，真菌交配型基因通常含有MAT1-1和MAT1-2两种类型。由图4结果显示，菌株LM2、LM6只含有交配型基因MAT1-2，菌株LM5只含有交配型基因MAT1-1，菌株LM1、LM3、LM4同时含有2 种交配型基因。当2 个交配型基因同时存在时，羊肚菌才能实现子实体正常发育和产生子囊孢子；而一种交配型基因缺失或衰弱，会导致产量减少或者无法出菇。由此说明，LM1、LM3、LM4能够进行有性生殖实现子实体正常发育和产生子囊孢子，因此在后续研究中仅从这3 株菌中筛选确定优质菌株。

04

3 株羊肚菌的菌丝活力

4.1 菌丝体生物量

如图5所示，LM1、LM3、LM4 3 株菌在液体培养5 d时的菌丝体生物量均达到最高峰，明显高于其余培养时间；其中，LM4菌株生物量最高，为0.957 3 g，LM1生物量最低，为0.891 9 g。当培养周期超过5 d后，3 株羊肚菌的菌丝体生物量基本恒定。

4.2 酶活力和MDA含量

由图6可知，LM4菌株的POD活力均显著高于LM1和LM3；LM4菌株的CAT和TTC-脱氢酶活力明显高于LM3，但与LM1差异不显著；LM4菌株的PPO活力明显高于LM1，但与LM3差异不显著，由此可见，菌株LM4相较于LM1、LM3有较强抵御外界环境压力的能力，清除ROS能力更强。另一方面，MDA是脂质过氧化物的分解产物，可用于评估细胞氧化损伤中的膜脂质氧化情况。LM4菌株的MDA含量（2.337 μmol/g）显著低于LM1（3.606 μmol/g）和LM3（2.922 μmol/g），说明菌株LM4的细胞损伤情况明显小于菌株LM1和LM3，在清除ROS方面具有更为优越的能力，进而可能赋予其在液体栽培过程中良好适应性和出菇稳定性。

已有研究表明，真菌交配型基因不仅决定其交配方式，还可能影响菌株生理活性、代谢调控及抗氧化能力。在本研究中，LM4菌株表现出较高酶活力，其机制可能与特定交配型基因表达模式密切相关。在MAT1-1和MAT1-2的协同调控下，LM4菌株可能能激活一系列与抗氧化防御及细胞保护相关的基因，从而促进CAT、POD、TTC-脱氢酶及PPO的高效合成和活性维持，进而增强ROS清除能力并降低脂质过氧化水平。上述机制为LM4菌株在生理活性及环境适应性方面的优势提供了分子生物学依据。

4.3 菌丝体活力指标相关性分析

由表3可知，3 株优质菌株的酶活力和抗氧化物质含量均存在显著差异，其中，TTC-脱氢酶活力差异显著，CAT、PPO、POD、菌丝体生物量及MDA含量差异极显著。进一步由表4可知，菌丝生物量与CAT、PPO、POD活力均呈极显著正相关，与CAT、TTC-脱氢酶活力呈正相关，表明菌丝生物量越高，菌丝酶活力越强；抗氧化酶之间也表现出密切相关性，PPO活力与POD活力呈极显著正相关（r＝0.856，P＜0.01），POD活力与CAT活力呈正相关（r＝0.412），表明这些抗氧化酶可能在ROS清除过程中协同发挥作用。另一方面，TTC-脱氢酶活力与CAT活力呈显著正相关（r＝0.704，P＜0.05），但与POD和PPO活力的相关性不显著，说明TTC-脱氢酶主要与线粒体电子传递链相关，而抗氧化酶系统可能更倾向于通过CAT、PPO和POD的协同作用调节ROS水平。此外，菌丝生物量与MDA含量呈极显著负相关（r＝—0.965，P＜0.01），PPO和POD活力也分别与MDA含量呈极显著负相关（r＝—0.892、—0.849，P＜0.01），进一步表明当抗氧化酶活力较高时，菌丝体能够更有效地清除ROS，从而减少脂质过氧化对细胞的损伤。

抗氧化酶CAT、PPO和POD之间的极显著相关性及其对菌丝生物量的影响表明抗氧化系统的协同作用可能是促进羊肚菌生长的关键因素之一。此外，随着菌株生长繁殖，MDA的积累会降低ROS清除能力，进而加剧脂质过氧化，导致细胞损伤。因此，羊肚菌的酶活力和抗氧化能力不仅与菌丝体生物量密切相关，而且不同酶活力之间也相互影响，这些因素共同决定了羊肚菌菌株的生长状态和抗逆能力。

05

优质野生羊肚菌的确定

采用隶属函数法对3 株优质羊肚菌的CAT、TTC-脱氢酶等抗氧化酶以及抗氧化物质含量进行综合评价。由表5可知，菌株LM4的平均隶属函数值（0.964 7）明显高于LM1和LM3，而菌株LM4的MDA隶属函数值明显低于LM1和LM3。因此，综合判定LM4菌株是一株菌丝活力强、逆境抵御能力强的优质野生羊肚菌。

06

结 论

利用单基因和多基因测序方法对6 株野生羊肚菌进行形态学及分子生物学鉴定，发现6 株野生羊肚菌均为六妹羊肚菌（M. sextelata），属于黑色羊肚菌（Elata Clade）类群；结合交配型基因测定结果，判定LM1、LM3、LM4 3 株羊肚菌含有MAT1-1和MAT1-2两种交配型基因，能进行有性生殖。同时，菌株LM4的CAT、PPO、POD、TTC-脱氢酶等酶活力指标均高于LM1和LM3，MDA含量明显低于LM1和LM3，通过隶属函数法评价菌株LM4的生理活力最好。因此，LM4菌种是一株具有开发潜力的优质羊肚菌，可以推荐作为后续栽培种植的试用菌株之一。未来，深入探讨LM4菌株在不同栽培条件下的生长表现，以验证其实际生产的适应性和种植栽培应用效果是必要的；同时结合转录组学、代谢组学等分析技术，解析LM4菌株在生理活力提升及抗逆性增强方面的关键分子机制。另一方面，还需扩大采集菌株的样本规模进而建立面向生产目标的菌种资源库，为羊肚菌的高效栽培及遗传改良奠定基础。

通信作者

任海伟 教授

兰州理工大学生命科学与工程学院 院长

任海伟，博士（后），教授，博士生导师，现为兰州理工大学生命科学与工程学院院长，甘肃省食药资源开发与生物制造行业技术中心主任。甘肃省领军人才，首批陇原青年英才，甘肃省青年教师成才奖获得者，甘肃省高等学校创新创业教育名师，陇原青年创新创业人才，第十五批“西部之光访问学者”，中科院“西部青年学者”，甘肃省科技特派员，甘肃省首批知识产权专家库专家，甘肃省省级食品检查员，金城首席科普专家。兼任中国治沙暨沙业学会文冠果及木本油料专业委员会副主任委员，中国食用菌协会羊肚菌产业分会副主任委员，《食品工业科技》编委，《食品研究与开发》编委，甘肃省黄河流域生态保护和高质量发展专家库专家等。主持完成国家自然科学基金、中国博士后科学基金（特别资助和一等面上资助）、甘肃省自然科学基金重点项目等20余项课题，参与国家863计划、国家国际科技合作专项等课题5 项，公开发表学术论文120余篇，其中SCI/EI收录50余篇，授权发明专利16 件，授权实用新型专利和软件著作权40余件，获甘肃省科技进步二等奖、甘肃省教学成果二等奖、甘肃省高等学校科学研究优秀成果一等奖等奖励。

本文《6 株野生羊肚菌的分子鉴定及高活力菌株筛选》来源于《食品科学》2025年46卷第13期86-93页，作者：向雨萌，吴琦，任海伟，田亚琴，郭晓鹏，刘前逵，王雅钰。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250107-047。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑：李雄；责任编辑：张睿梅。点击下方 阅读原文 即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

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