双特异性抗体的链配对技术

引言

近年来，双特异性抗体已成为一种关键的药物形式，它们能够实现传统单特异性抗体难以实现的独特功能。例如，T细胞接合器和能够模拟凝血因子VIII的emicizumab。因此，双抗具有相当大的治疗潜力。然而，虽然IgG型的双抗可以在研究规模上成功产生，但由于其结构的复杂性，它们作为药物制剂的商业制造一直面临着重大挑战。这些挑战以多种方式表现出来：控制表达的困难，实现高纯度纯化的障碍，以及高昂的生产成本，所有这些都阻碍了它们成功转化为临床可行的候选药物。今天，我们就来回顾一下IgG型双特异性抗体链交换技术的发展和最新进展。

一、IgG型双抗的复杂性和早期纯化策略

四链双特异性抗体有两条不同的重链，分别负责识别两个不同的靶点，还有两条不同的轻链来配合它们结合靶标。当细胞在同时表达这四种基因并进行组合时，会产生十种可能的组合！而正确配对的只是其中一种，剩下的九种都是错误配对的杂质。此外，这十种组合，分子量、电荷性质都差不多，几乎无法用普通的色谱柱把它们分开！因此，早期双抗的工业化生产相当困难。

面对这十种组合，人们一开始使用的是抗原固定化亲和层析。也就是把双抗结合的两种抗原分别固定在两根柱子上。先把细胞培养液过第一根柱子，双抗会跟抗原1结合被留下来，去除其它杂质。然后用特定条件把双抗洗下来，再过第二根装了抗原2的柱子，双抗又会跟抗原2结合被留下，再洗脱。这样理论上就能得到纯的双抗了。这种方法虽然有效，但是这些抗原蛋白往往受不了碱性条件，柱子寿命短，再利用率低，生产成本很高。

二、链配对技术的突破

如何既要让细胞更容易产生我们想要的双抗，又能让后续的纯化过程更简单、更高效呢？科学家们经过不断的探索，获得了很多技术突破，包括了三种抗体工程技术：通用轻链，调整等电点，以及促进正确的重链二聚化。

通用轻链

通用轻链就是把不同的重链组合分别跟它们各自的原配轻链一起表达，看看哪些组合还能保持活性，从中筛选出一个相对靠谱的通用轻链。找到之后，在用FR（CDR）shuffling的方法，对这个通用轻链进行微调，确保它跟两个重链都能很好的匹配。这种方法可行，但是筛选过程非常耗时耗力，而且通用轻链往往是妥协的结果，可能对其中一个靶点结合不完美，甚至牺牲掉一部分活性。

等电点工程

蛋白质在溶液中会带有电荷，这个电荷特性可以用等电点pI来衡量。不同的蛋白质，pI值不一样，在离子交换色谱柱上的行为也就不同。这种技术的思路是，在其中一个重链的可变区VH上引入一些氨基酸突变，人为地改变这个双抗的pI值，让它跟那些错误配对产生的单抗的pI值拉开差距。这样一来，它们在离子交换柱上的保留时间和洗脱顺序就不一样了，很容易就把它们分开。通常这个步骤会放在Protein A纯化之后，作为最后的精致步骤，进一步提高纯度。

重链异源二聚化

促进重链异源二聚化。就是让正确的两个不同重链优先结合，形成我们想要的异源二聚体。人们已经开发了许多方法，一种经典的方法叫Knobs into Holes，简称KiH。就是在两个不同重链的CH3结构域上进行突变，让它们像齿轮一样必须互相咬合才能稳定结合。另一种方法是利用电荷排斥或吸引，比如使用E356K和K439E突变，通过引入带相反电荷的氨基酸对，来引导正确的重链配对，并排斥掉同源的重链。

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三、链配对技术平台

利用这些技术，研究者们开发了不同的技术平台，比如中外制药开发的FAST-Ig技术，罗氏的CrossMab技术平台以及可控Fab臂交换技术（cFAE）。

FAST-Ig

FAST-Ig的全称是Favored Assembly by Specific electrostatic interactions for Ig，翻译过来就是通过特定的静电相互作用来实现抗体的优选组装。这个技术的核心在于，它不依赖于找一个通用的轻链，而是直接在重链和轻链的结合界面，以及重链之间的界面上，精确地引入一些带相反电荷的氨基酸。比如，在重链和轻链的接触点放一对正负电荷，强制它们必须正确配对才能结合；在重链之间也放类似的设计，促进它们形成异源二聚体。这样一来，就像给正确的组装过程加了导航和助推器，大大减少了错误配对的可能性。

CrossMab

CrossMab是由罗氏公司开发的技术平台。这种方法在Knobs-into-holes方案的基础上，进一步解决了轻链错误配对的问题，简单的说，这项技术首先在Fc区设计了KiH异源二聚体连结，同时将Fab区域的CH1和CL互换，通过氨基酸序列的互换，使得同源区域，比如VH与VH、CH1与CH1产生空间位阻，从而减少轻链错配。Crossmab主要有3种类型，crossmab-fab，重链交换整个Fab区作为新的"轻链"，原来的轻链作为新的"重链"连接到Fc铰链区。Crossmab-VH-VL，这种类型仅交换可变区。Crossmab-CH1-CL，这种类型仅交换恒定区。

可控Fab臂交换

我们体内的IgG有4个亚型，其中的IgG4有一个特殊的能力，就是它的两个Fab臂可能会在体内随机地跟别的IgG4分子的Fab臂互换，结果就是原本只结合单个抗原的IgG4，可能变成一个能结合两个抗原的双价形式。IGG4的这种Fab臂交换过程由氧化还原条件控制，IgG4的两个特征使Fab臂交换得以发生，铰链区中的228位的丝氨酸和CH3结构域中409位的精氨酸。前者通过二硫键导致两条重链之间异常不稳定的共价相互作用，后者通过CH3结构域削弱了两条重链之间的非共价结合。

通过工程化改造，我们就可以控制IGG的Fab臂交换，也就是cFAE技术。它的核心思路非常巧妙，不需要动抗体的Fab臂部分，只需要在两个不同抗体的CH3结构域上，分别引入一对特定的突变，比如一个抗体上是F405L，另一个是K409R。这两个突变使各自的同源二聚体抗体不稳定，在还原剂的作用下解离，然后它们就更倾向于跟对方那个带有互补突变的抗体结合，形成异源二聚体。

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结语

双抗这种神奇的分子，要想从实验室走向临床，背后离不开两大支柱。一个是不断精进的抗体工程技术，负责让这些复杂的分子能够被高效、稳定地生产出来；另一个就是日益成熟的蛋白质纯化技术，负责把这些粗制的原料提纯成符合标准的药品。两者缺一不可。未来，随着这两方面技术的深度融合，我们有理由相信，双抗的开发风险会大大降低。

参考文献：

1.Discovery and development of bispecific antibodies. Protein Expr Purif. 2025 Aug 5:236:106787

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