Cell丨ZNFX1直接泛素化RNA在免疫应答中的作用

撰文丨易

先天免疫系统通过识别病原体相关分子模式（PAMPs）来抵御微生物入侵，其中病毒核酸在异常细胞区室中的出现是关键的触发因素。这一识别会启动信号传导，诱导细胞因子表达和干扰素（IFN）刺激基因（ISGs）的激活，从而直接抑制病原体。泛素化作为一种广泛的翻译后修饰，在病原体信号传导和限制中扮演核心角色，例如K63连接的多聚泛素链可介导炎症信号，而其他类型的链则可能靶向病毒组分进行蛋白酶体降解或引导细菌的自噬清除。尽管近年来发现了如RNF213等非经典泛素连接酶能够泛素化非蛋白底物（如脂多糖），但另一种含有RZ结构域的蛋白ZNFX1的功能机制仍不明确。ZNFX1作为一种ISG防御因子，在抵抗RNA病毒中起关键作用，但患者中的双等位基因突变会导致过度炎症和对多种病原体的易感性，表明其功能复杂且至关重要。

近日，奥地利维也纳生物中心Tim Clausen和Daniel B. Grabarczyk在Cell期刊发表题为A split-site E3 ligase mechanism enables ZNFX1 to ubiquitinate and cluster single-stranded RNA into ubiquitin-coated nucleoprotein particles的研究论文，揭示了ZNFX1作为核酸激活的非常规E3连接酶，通过单链核酸诱导的寡聚化形成分裂活性中心，实现RNA泛素化并组装成泛素包被的核蛋白颗粒，这一机制对细胞在免疫应答中的存活至关重要。

本研究系统揭示了ZNFX1作为核酸激活的非经典E3连接酶的独特机制和生物学功能。首先，发现ZNFX1的E3连接酶活性严格依赖于单链核酸（ssRNA或ssDNA）的存在，且具有显著的长度依赖性——短于80 nt的核酸几乎无法激活其活性，而500 nt以上的长链核酸（如M13噬菌体基因组）能引发最强的激活效应。这种激活机制的核心在于ZNFX1的寡聚化：通过冷冻电镜和负染色电镜结构分析，观察到ZNFX1在长链ssNA上形成特定的二聚体结构，该二聚化由N端的ARM结构域介导，其疏水界面（975 Ų）通过X射线晶体学得到证实。这种二聚化使两个ZNFX1分子的E3模块在空间上接近，形成反式互补的活性中心——一个分子的Z-RING结构域与另一个分子的RZ结构域协同工作，实现高效的泛素转移。

进一步的功能实验表明，ZNFX1的激活需要ATP水解驱动的5'至3'转位活性。通过DNA交换实验和末端封闭策略，证明ZNFX1与其他UPF1家族解旋酶类似，能够沿核酸链定向移动，且这一过程是E3活性激活的必要条件。

泛素化机制分析揭示了一个三步序贯反应：Z-RING首先结合E2∼Ub并稳定其闭合构象（依赖F1574/F1575残基形成的疏水界面）；随后泛素被转移至RZ结构域的催化半胱氨酸（C1860）；最后RZ结构域催化底物泛素化。此外，ZNFX1不仅能泛素化蛋白质底物（主要形成K48和K6连接的多聚泛素链，与降解和异源自噬相关），还能直接泛素化RNA的2'羟基基团，形成酯键连接的泛素化RNA。这一活性高度依赖RZ结构域与泛素的闭合构象（由I1835介导）及保守组氨酸（H1881）的催化作用，突变这些残基（如I1835S或H1881A）会完全破坏RNA泛素化能力，但对蛋白泛素化仍有部分残留活性。

更重要的是，本研究发现ZNFX1在长链ssNA上形成高密度核蛋白颗粒。原子力显微镜和电镜观察显示，ZNFX1与M13 ssDNA或线性ssRNA结合后，会压缩核酸形成球状凝聚体，这些颗粒表面被泛素包裹。这种凝聚现象具有浓度依赖性：中等浓度核酸最大程度促进寡聚化和活性，而过高浓度反而因分子间距增大导致活性下降。细胞实验中，ZNFX1在胞内与外来RNA共定位并形成泛素阳性焦点，证实了这一机制在生理环境下的相关性。功能上，ZNFX1缺失细胞在IFN刺激或RNA电转后出现显著存活率下降，并伴随未折叠蛋白反应和凋亡相关基因（如DDIT3）的上调，且这一现象独立于MAVS信号通路。通过点突变回补实验，作者证实E3连接酶活性（尤其是CA、FFAA、IS突变及患者突变C1264S/C1292S）是ZNFX1保护功能的核心：这些突变体虽保留核酸结合能力，但无法拯救细胞存活缺陷。值得注意的是，能保留羟基泛素化活性的QA突变体仍具部分救援能力，而IS突变体（羟基泛素化缺陷）则完全失效，提示对RNA的直接泛素化在ZNFX1的生物学功能中可能发挥关键作用。

总而言之，本研究揭示了ZNFX1的分子机制：通过解旋酶作为核酸传感器与具有分裂活性位点的非常规E3模块的协同作用发挥作用。单链RNA通过促进ZNFX1亚基的二聚化来刺激E3活性，这些亚基可沿核酸链进行移位。并列的E3结构域相互补充，导致ZNFX1自身及其结合的RNA分子发生泛素化，同时将核酸聚集形成致密的核蛋白颗粒。本研究证明ZNFX1的E3连接酶活性在免疫应答过程中保护细胞，并提出由ZNFX1形成的泛素包被颗粒代表了一种古老的调控机制，用于管理细胞中外源与内源RNA。

https://doi.org/10.1016/j.cell.2025.08.006

制版人： 十一

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