Nature | 张燕/侯仲刚合作揭示Cas9感知CRISPR RNA丰度以调控细菌适应性免疫记忆的形成

CRISPR-Cas系统是细菌和古细菌中广泛存在的一类获得性免疫机制，其核心功能在于通过“分子记忆”和“精准切割”抵御外源噬菌体和核酸的入侵。该系统由两大关键组成部分构成：一是CRISPR 阵列，作为免疫记忆库，存储着既往入侵噬菌体、质粒或其他外源核酸的片段（记忆称为 spacer）；二是Cas蛋白，作为效应分子，负责识别并切割与spacer匹配的外源入侵者。典型的单效应核酸酶包括 Cas9、Cas12以及Cas13，其系统结构相对简单，分子机制被充分解析，并被开发为突破性的基因编辑，表达调控，和疾病治疗的工具，极大推动了生命科学与医学的发展(Science, 2018, 361(6405):866-869)。鉴于Emmanuelle Charpentier和Jennifer Doudna在Cas9对推动分子魔剪技术发展中的核心贡献，二人于2020年被授予诺贝尔化学奖。

重要的是，Cas9的已知效应功能均依赖两条小RNA—crRNA 与tracrRNA—共同形成靶向复合物；不携带RNA的apoCas9被认为处于惰性、不具备内源生物学功能。

CRISPR-Cas介导的免疫过程可分为三个阶段：其一，适应阶段（Adaptation），‌当噬菌体或质粒首次入侵时，Cas1-Cas2复合物会把外源DNA中的特定序列整合到宿主CRISPR阵列的前导区（leader）与重复序列之间；其二，表达阶段（Expression），‌CRISPR阵列被转录为长链pre-crRNA后，通过宿主RNase酶或Cas蛋白加工成成熟的crRNA；其三，干扰阶段（Interference）‌，Cas蛋白（如Cas9）与guide RNA组装成效应复合物，其通过crRNA的spacer序列识别互补的外源DNA并启动切割清除。

关于适应阶段，外源核酸前体片段（prespacer）如何由Cas1–Cas2复合物整合到CRISPR阵列中，成为新的spacer，已在大肠杆菌的I-E型CRIPR-Cas中得到深入解析。中国科学院生物物理研究所王艳丽研究员团队报道了I-E型Cas1–Cas2如何通过PAM识别实现prespacer的选择 (Cell, 2015, 163(4):840-53)；加州大学Jennifer Doudna教授与耶鲁大学可爱龙教授团队则分别报道了Cas1–Cas2–prespacer–target DNA复合物结构(Nature, 2017, 550(7674):137-14; Science, 2017, 357(6356):1113-1118)。在很多其他CRISPR-Cas系统中，spacer的选择与整合还需要额外因子的协同作用。例如，可爱龙教授团队结构上阐明了Cas4如何识别PAM，并协助Cas1–Cas2实现spacer的单方向性整合(Nature, 2021, 598(7881):515-520)。对于CRISPR-Cas9系统如何产生免疫记忆，细菌分子遗传学揭示了在II-A型系统中，Cas9与tracrRNA协同，通过PAM识别参与prespacer的筛选 (Nature, 2015, 519(7542):199-202)。然而，Cas9、tracrRNA以及CRISPR RNA在适应过程中的具体分子机制仍不清楚。

此外，除II-A型外，CRISPR-Cas9系统适应阶段的研究整体仍相对匮乏。多种Cas9亚型中，II-C例接近一半且架构最简单，并被视为比II-A更古老的Cas9分支。仅保留cas1、cas2、cas9 和tracrRNA基因，而缺乏csn2、cas4等辅助因子，其精简的遗传架构提示该系统的适应性免疫阶段的分子机制可能有别于II-A亚型，为探索spacer获取机制提供重要切入点(Nat Rev Microbiol, 2017, 15(3):169-182)。

2025 年 9 月 3 日，密歇根大学医学院张燕教授和侯仲刚教授领导的研究团队在Nature杂志发表了题为

Cas9 senses CRISPR RNA abundance to regulate CRISPR spacer acquisition

此项研究由课题组的周旭飞博士主导，历时六年，以天然宿主脑膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitidis, Nme）为研究对象，借助强有力的分子遗传工具，先后构建上千株突变体，创建了II-C型CRISPR-Cas的适应性免疫记忆检测体系。在读博士生李鑫则建立了脑膜炎奈瑟菌的天然丝状噬菌体的制备和宿主侵染平台，并完善了通过高通量测序解析免疫记忆的发生特征。周旭飞博士主导将上述平台进行有机整合，并在合作者Lydia Freddolino教授实验组的生物信息学支持下，系统性解析了apoCas9的全新功能。

当tracrRNA或crRNA单独缺失，或二者同时缺失时，NmeCas9处于“apo”游离态，会触发“超级适应”。此时获取新spacer的效率较野生型显著大幅提高。进一步的遗传互补实验表明，在双RNA同时缺失的背景下，只有同时补回tracrRNA和crRNA，才能完全逆转该表型，而单独补回任一RNA组分均不足以恢复。值得注意的是，这一“超级适应”现象的发生既不依赖于Cas9的核酸内切酶活性，也并非源于Cas9或Cas1在蛋白表达水平的变化，而是反映了apoCas9的内在调节激活作用。

NmeCas9由识别叶（REC lobe）和核酸内切酶叶（NUC lobe）两部分构成。REC lobe包括REC1、REC2结构域和桥螺旋（bridge helix），主要负责RNA的结合以及RNA-DNA杂交体的装载。NUC lobe包含RuvC、HNH切割结构域和C端PAM识别结构域（WED/PI domain）。通过对apoCas9的结构域进行系统性删除分析发现：如果仅保留NUC叶，仍能推动“超级适应”来高效促进spacer获取，但已失去对tracrRNA–crRNA调低的响应。相反，当删除到NUC叶内的RuvC、HNH或WED/PI结构域时，Cas9则完全丧失驱动“超级获取”的能力。这表明NUC叶是驱动spacer高效获取的核心因素，而两个RNA则通过REC叶来约束并从而精准调控spacer获取效率。值得注意的是，靶向切割外源核酸时则不同，Cas9干扰依赖于所有结构域的同时存在。

张燕团队进而一步展示了三类生理情境，揭示apoCas9通过感知crRNA的丰度，并自我反馈来调节spacer获取效率。例如，在CRISPR array新生早期进化阶段，长度较短，crRNA产量低，宿主体内Cas9多以 “apo” 游离状态存在，促使宿主高效获取记忆，从而帮宿主快速丰富免疫记忆库。随记忆持续积累，CRISPR array增长，crRNA丰度也随之升高，Cas9蛋白逐渐转向RNA介导的 “holo” 状态，进而导致apoCas9减少，spacer获取效率下降。由此实现免疫的闭环平衡调节，防止在CRISPR够长时维持高水平spacer获取，进而产生源于自身DNA的自免疫记忆。除此之外，CRISPR array的稳定性和长度还会受其他自然因素的影响，例如自免疫或者重复序列之间同源重组都可能诱发array塌缩和crRNA丰度骤降，使Cas9变到 “apo” 游离状态，短期启动高效的spacer获取能力，来维护免疫的深度。

综上，本研究不仅突破了以往对apoCas9“功能空白”的传统认知，还将其确立为免疫记忆深度的“捍卫者”：既作为感应器来感知crRNA丰度，又作为效应器在crRNA稀缺时促进高效获取免疫记忆，缩短宿主易感窗口期。这一动态调控机制不仅解释了寄主如何在CRISPR列阵塌缩后迅速回补，为理解宿主-噬菌体分子博弈提供了新视角，也凸显了Cas9主要亚型间适应机制多样性。同时也为未来基于CRISPR免疫适应机器的分子记录，谱系追踪，抗噬菌体工程等应用和优化，奠定了理论基础。

张燕(Yan Zhang)博士现任密歇根大学安娜堡分校长聘副教授，医学院RNA设计与合成核心平台联合负责人，长期深耕CRISPR-Cas领域。以通讯作者在Nature、Science、Molecular Cell等期刊发表论文十余篇。她在密歇根大学的团队曾阐明II-C型NmeCas9靶向RNA的分子机理，并聚焦于apoCas9在细菌获得性免疫记忆形成和调节中的关键作用。近年也致力于推动I型CRISPR-Cas基因编辑工具的系统性开发应用，包括建立Cas3介导的人细胞大片段基因敲除法，鉴定I-C型CRISPRC-Cas隐藏的Cas11组分，开发迷你I型基因敲除和调控工具，并引入anti-CRISPR作为可控安全开关。此外，通过与可爱龙教授团队合作阐明了Cas3的活化与抑制的结构基础。张燕教授实验室正在招聘1-2位博士后研究员，欢迎有以下方向背景的优秀人才加入，共同 开展创新性研究：生物信息与人工智能，细菌天然免疫，或基因编辑疾病治疗。有兴趣者请投递简历。

简历投递（ 有意者请将个人简历等材料发至 ）：

https://jinshuju.net/f/ZqXwZt或扫描二维码投递简历

https://www.nature.com/articles/s41586-025-09577-9

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