北化工团队开发碱基编辑系统，增强圆红冬孢酵母游离脂肪酸产量

近年来，全球面临的能源与化工原料可持续挑战日益突出，如何利用绿色生物技术，将廉价原料转化为高附加值化学品，成为合成生物学和代谢工程领域的重要课题。油脂酵母因其强大的脂质积累能力和环境适应性，被视为潜力巨大的“未来工厂”。

其中，圆红冬孢酵母（Rhodotorula toruloides）因能够高密度生长、合成多种脂质衍生物和类胡萝卜素，而受到研究者的高度关注，然而，受制于遗传操作工具不足，这一非模式微生物的代谢工程开发长期受限。

近日，北京化工大学史硕博团队在 ACS Synthetic Biology 发表了一篇题为“Enhancement of Free Fatty Acids Production in Rhodotorula toruloides Using the CRISPR/Cas9-Based Base Editor”的论文。研究团队首次在圆红冬孢酵母中开发了一种精准特异的基因编辑工具，基于 CRISPR/Cas9 的胞嘧啶碱基编辑器（CBE）系统，以拓宽其遗传工具箱，突破了遗传修饰效率低和选择标记受限的瓶颈，并成功利用这一工具改造脂质代谢通路，最终获得了游离脂肪酸（FFAs）产量达 512.3 mg/L 的工程菌株，为生物基油脂及衍生物的可持续生产提供了新路径。

碱基编辑器系统是 CRISPR/Cas 技术的重要衍生工具，它通过将脱氨酶与缺陷型 Cas9 或切口酶 Cas9 融合实现对特定碱基的直接修改，无需引入双链断裂（DSB）或依赖供体 DNA，该技术绕过了同源重组 (HR) 依赖性编辑的局限性，使其特别适用于 HR 效率较低或对外源 DNA 递送具有耐受性的生物体。

在圆红冬孢酵母中，传统的 CRISPR/Cas 介导的编辑依赖于 DSB 诱导后的 NHEJ，该过程易产生随机插入缺失突变。

相比之下，碱基编辑系统具有两大优势：消除 DSB 相关的基因组不稳定性和 NHEJ 衍生的诱变，从而提高编辑精确度；不依赖 HR 机制，这对 HR 效率低下的圆红冬孢酵母尤为关键。

实际实验中，研究人员在 R. toruloides NCYC 1585 里建立了两种基因编辑工具：ABE（腺嘌呤碱基编辑器）和 CBE（胞嘧啶碱基编辑器）。两者的核心都是经改造的 Cas9 蛋白，分别与腺嘌呤脱氨酶或胞嘧啶脱氨酶融合。

图 | 在圆红冬孢酵母中构建的 ABE 和 CBE

在 CBE 系统中，研究人员还额外融合了尿嘧啶糖苷酶抑制蛋白（UGI），用于阻断内源性尿嘧啶-DNA 糖苷酶（UNG）的作用，从而避免 C-U 脱氨后产生的U被识别和切除，保证了 C-T 突变能够稳定保留下来。

为了验证编辑效率，研究人员选择了类胡萝卜素合成相关基因 CAR2 和 CRTI 作为靶点，由于这两个基因的失活会导致菌落颜色由红色转变为白色，因此能够通过表型快速判断编辑结果。

图 | CBE 系统能高效敲除类胡萝卜素合成基因 CAR2 和 CRTI，从而使菌落颜色由红变白

实验表明，CBE 系统表现良好，在转化后的培养板上出现了大量白色克隆，经测序证实，这些克隆均在靶点序列中成功引入了提前终止密码子（如 CAA-TAA、CGA-TGA、CAG-TAG），从而有效地关闭了目标基因，其单基因编辑效率最高可达 90%。

相比之下，ABE 系统的表现就不太理想，研究人员尝试通过改变起始密码子（ATG）来敲除基因，但没有检测到有效突变，推测可能是该酶在圆红冬孢酵母里活性不足。

更有意思的是，以往在另一种酵母解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）中使用 CBE 时，经常会产生意想不到的“移码突变”，而在本研究中，圆红冬孢酵母的 CBE 系统没有出现任何类似错误，说明这个系统在这种酵母里不仅高效，而且非常精确。

为进一步提升遗传操作的可持续性和迭代能力，研究团队还创新性地开发了一种以雌二醇诱导的 Cre-loxP 系统。其中，Cre 重组酶能够与雌二醇结合域（EBD）融合，在无雌二醇时位于细胞质中无活性，加入雌二醇后则转入细胞核识别 loxP 位点并切除其间序列，从而实现标记基因的回收。这意味着科研人员在完成一次基因改造后，可以“清除”掉已使用的选择标记，为下一步改造留下空间。这一系统化工具为复杂的多基因改造奠定了坚实基础。

在工具建立完成的基础上，研究人员进一步对圆红冬孢酵母进行脂质代谢通路重构，脂肪酸在细胞内往往会被进一步活化或分解，限制了游离脂肪酸的积累。为此，团队设计性地敲除了包括 FAA1、FAA4、POX1 和 PXA1 在内的关键基因，阻断了脂肪酸活化和 β-氧化途径，使代谢流量更多地流向游离脂肪酸的积累。

图 | 针对脂质代谢相关基因的改造显著提升了游离脂肪酸的产量

结果表明，改造菌株的游离脂肪酸产量显著提升，其中最佳菌株可达到 512.3 mg/L，是野生型菌株的 25 倍左右。值得注意的是，这些改造并未对菌株的生长速率和葡萄糖消耗产生明显负面影响，显示出良好的工业应用潜力。

本研究不仅是圆红冬孢酵母遗传工具箱的重大扩展，也为非模式微生物代谢工程提供了通用思路。通过 CBE 与 Cre-loxP 的结合，研究人员建立了一个高效、可迭代、可扩展的基因编辑平台，并显著提升了游离脂肪酸产量，有望为可持续油脂与化学品的绿色制造提供新范式。

参考文献：

1.https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.5c00359

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