神经环路应用（4）：在体双色光纤记录案例解析

理解慢波睡眠（SWS）觉醒的潜在机制对于揭示动物睡眠与感觉反应之间的复杂相互作用至关重要。丘脑传统上以将感觉信息传递至皮层而闻名，但在慢波睡眠期间其功能会下降。动物能在外部感觉刺激下从慢波睡眠迅速转为清醒状态，这暗示存在调控该现象的特殊神经回路。该案例聚焦于同步记录背内侧丘脑中的 GRIK4 细胞（称为 B 型细胞）及其从中脑区域 CaMK2 细胞（称为 A 型细胞）接收的输入的神经元活动。通过双色光纤记录技术，同时监测小鼠丘脑中两种不同神经群的钙信号活动，以探究其在生理过程（如睡眠-觉醒转换）中的功能机制，并可整合脑电图（EEG）和肌电图（EMG）记录，实现多维度数据关联分析。

目的：

为 MD 丘脑中的细胞类型 B（GRIK4 细胞）和中脑区域的细胞类型 A（CaMK2 细胞）注射基因编码钙指示剂。

实验步骤：

• 病毒注射：

MD 丘脑（细胞类型 B）：坐标为前囟后 1.50mm，左右 + 0.35mm，注射体积 300nL，针尖最终 DV 位置 3.37mm。

中脑区域（MN，细胞类型 A）：坐标为前囟后 4.44mm，左右 + 1.16mm，注射体积 250nL，针尖最终 DV 位置 3.62mm。

术后处理：注射完成后等待 10 分钟再撤回注射器，缝合皮肤，消毒并将小鼠置于单笼并给予红外光保暖。

• 光纤植入：

麻醉与固定：同病毒注射步骤。

头部处理：去除头顶毛发，消毒，切开约 1cm 直径的皮肤，清理颅骨表面。

锚定：在距目标区域约 1cm 处插入螺丝作为固定连接的锚点（不穿透颅骨）。

定位与钻孔：确定 MD 丘脑目标位置（同病毒注射坐标），钻孔，直径略大于光纤套圈直径。

植入光纤：将光纤套圈置于目标区域，最终坐标为前囟后 1.50mm，左右 + 0.35mm，DV3.33mm。

固定：混合牙科聚合物粉末、单体溶液和催化剂覆盖光纤、颅骨和螺丝，待固化后再涂自固化粘合剂，完全干燥后移除光纤支架。

术后恢复（2 周）：让动物至少休息 2 周，减少操作。

Fig1 利用双色光纤光度法记录两种离散神经群

该系统使用 465nm 和 560nm 的激发光，其中 465nm 光激发细胞类型 A（中脑区域的 CaMK2 细胞）表达的 GCaMP6m，产生的荧光信号由一个光电探测器接收；560nm 光激发细胞类型 B（MD 丘脑中的 GRIK4 细胞）表达的 jRCaMP1a，其荧光信号由另一个光电探测器接收实现了两种信号的同时采集。

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体内数据采集：

组装光纤光度装置，本实验中使用 GCaMP 和 Red Opsin 光纤记录系统检测 GCaMP6m 和 jRCaMP1a 信号。

光漂白：记录前 1 小时进行光漂白，以减少自发荧光噪声。

光源设置：打开光纤线尖端的 465nm 和 560nm 激发光至最大功率，设置在 20-75mW 之间。

连接与记录： 将动物与光纤线连接，记录基线钙活性；将动物放入行为箱，进行感兴趣的行为测试并开始记录。

Fig2 MD 区 CaMKII 神经元（jRCaMP1a）和 MN 神经元突触终端（GCaMP6m）的双色光纤记录预处理与分析

图 B展示了 jRCaMP1a（CaMKII 神经元）和 GCaMP6m（MN 神经元突触终端）的原始信号轨迹。这些原始信号会经过低通滤波、下采样和移动平均去趋势处理，以去除噪声并标准化信号。

图 C呈现了通过移动平均法将信号转换为 ΔF/F（荧光变化率）的结果，以及经平滑处理后的信号。ΔF/F 计算用于量化钙信号的相对变化，平滑处理可减少高频噪声，突出信号趋势。

图 D展示了预处理后的 GCaMP6m（上）和 jRCaMP1a（下）的 ΔF/F 信号。图中紫色竖线标记了目标行为的起始点，用于分析行为事件与神经活动变化的时间关联。

图 4呈现了目标行为后信号急剧增加的起始点估计结果。通过信号导数的累积和超过阈值（事件前 5 秒窗口均值的 5 个标准差以上）来确定起始点，用于量化神经活动对行为事件的响应延迟。

总结

为将睡眠-觉醒状态与神经活动动态关联，案例整合了视频、脑电图（EEG）和肌电图（EMG）记录与双色光纤记录法。使用pClamp软件采集EEG和EMG信号，并通过自定义MATLAB脚本进行分析。在小鼠处于慢波睡眠（SWS，定义为EEG呈现高振幅、低频（0.5–4 Hz）的同步化波形且EMG活动降低）时，给予听觉刺激（11 kHz，1 s，100 dB），并同步记录神经活动与行为反应。手动确认睡眠状态和刺激时间点后，筛选出成功诱导觉醒（定义为EEG去同步化、低振幅，EMG活动增强）的试验事件。提取目标行为起始前后各10秒的光纤光度信号并以事件前10秒至0秒的信号均值作为基线进行校正，实现神经活动与行为转换的精确时间对齐分析。

注意事项

1、病毒注射过程延长注射序列中的扩散时间，并减慢针头撤回速度。

2、光纤记录中出现运动噪声或伪影记录前按 Doric Lenses 的《光纤线光漂白协议》对光纤线进行预漂白（参考链接：https://www.doriclenses.com/downloads/ApplicationNotes/LA；

3、使用更长的光纤线减少自由活动动物记录时的线缆张力，同时避免线缆缠绕；

• 数据采集时，荧光信号缺失或强度不足

信号弱多因光纤与基因编码钙指示剂表达部位距离过远，最佳距离为光纤尖端距荧光区域 100-200 μm；

4、若光纤尖端（植入的光纤套管或光纤线）脏污或损坏，用乙醇仔细清洁光纤尖端及光纤线两端，以提高光耦合效率。

• 轴突末梢的荧光信号通常较弱，信噪比较低，记录困难

为解决此问题，可采用“强弱搭配”的表达策略：在信号较弱的末梢区域表达荧光更强的指示剂（如jRCaMP1a），而在信号较强的胞体区域表达相对较弱的指示剂（如GCaMP6m），从而平衡双通道信号强度，提高数据质量。

文献引用：

1. Almas Serikov, Iryna Martsishevska, Wooyeon Shin, Jeongjin Kim,Protocol for in vivo dual-color fiber photometry in the mouse thalamus,STAR Protocols,Volume 5, Issue 2,2024,102931,ISSN 2666-1667,https://doi.org/10.1016/j.xpro.2024.102931.

2. Shin, A., Park, S., Shin, W., Woo, J., Jeong, M., Kim, J., and Kim, D. (2023). A brainstem-to mediodorsal thalamic pathway mediates sound-induced arousal from slow-wave sleep. Curr. Biol. 33, 875 885.e5. https://doi.org/10.1016/j.cub.2023. 01.033. during sleep. Science 309, 2228–2232. https:// doi.org/10.1126/science.1117256.
3.Reese, N.B., Garcia-Rill, E., and Skinner, R.D. (1995). The pedunculopontine nucleus— auditory input, arousal and pathophysiology. Prog. Neurobiol. 47, 105–133. https://doi.org/ 10.1016/0301-0082(95)00023-O.

4.Tang, Y., Benusiglio, D., Lefevre, A., Ku ¨ppers, S., Lapies, O., Kerspern, D., Charlet, A., and Grinevich, V. (2022). Viral vectors for opto electrode recording and photometry-based imaging of oxytocin neurons in anesthetized and socially interacting rats. STAR Protoc. 3, 101032. https://doi.org/10.1016/j.xpro.2021. 101032.

5. Massimini, M., Ferrarelli, F., Huber, R., Esser, S.K., Singh, H., and Tononi, G. (2005). Breakdown of cortical effective connectivity

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