Cell | CFAP36：纤毛内多聚泛素化蛋白逆向转运的新因子

撰文|存中一贯

纤毛和真核鞭毛是细胞表面负责感知觉、细胞间信号转导、细胞运动以及液流产生的细胞器【1】。纤毛蛋白质组的正常维持对于纤毛功能的持续发挥至关重要，这包括清除受损或定位错误的蛋白质等。这个过程的失衡经常导致一些人类纤毛疾病的发生，如多囊肾病、视网膜退行性病变和发育障碍等，如Bardet-Biedl和Joubert综合征等【2】。

纤毛蛋白质组由过渡区（transition zone）控制，该区域是纤毛基部的一道选择性屏障【3】。 许多蛋白质通过鞭毛内转运（intraflagellar transport,IFT）系统通过此屏障。IFT机器由两个多蛋白亚复合体IFT-A和IFT-B组成，它们与驱动蛋白（kinesin）和动力马达蛋白（dynein motor proteins）组成兆道尔顿级别的重复结构，称为IFT列车。这些蛋白质列车存在两种结构截然不同的构型，分别介导顺向（基部到顶端）或逆向（顶端到基部）的运动【4】。货物蛋白搭载IFT列车进行转运需要货物桥接蛋白的参与，但桥接蛋白识别货物蛋白、与IFT列车结合以及区分顺向与逆向运输的具体机制仍然未知。

研究发现，纤毛和鞭毛中蛋白质的转运与多聚泛素化密切相关，尤其是K63连接的多聚泛素化修饰与纤毛中蛋白质的转运和水平变化有关【5】。如Hedgehog信号通路（Hh）中一个关键穿膜蛋白SMO（smoothened）需要泛素化修饰维持其正常状态下的低表达水平，直到此信号通路被激活。利用去泛素化酶去除SMO的泛素化修饰或者删除泛素连接的氨基酸残基会导致SMO在纤毛中的积累，即使Hh信号通路未被激活【6】。

不过IFT机器并不直接结合多聚泛素链，说明存在将多聚泛素链连接到IFT列车上的桥接蛋白。现在的研究结果显示TOM1L2能够发挥这种功能，它是一种泛素reader蛋白，一种ESCRT（endosomal sorting complexes required for transport）途径中广泛使用的泛素阅读器，定位在纤毛里，能够结合K63连接的多聚泛素链，且其敲除会导致K63连接的多聚泛素链和SMO蛋白在纤毛中积聚【7】。进一步的研究显示，TOM1L2能够通过BBSome与IFT机器结合，这是一种能够起始顺行和逆行运输的八聚体复合物【8】。

然而，目前并无直接的证据表明TOM1L2单独可起始IFT过程，这使其在纤毛蛋白回收通路中的作用存疑。更令人困惑的是： 为何纤毛特异性运输通路IFT竟会完全依赖通用ESCRT亚基的多功能特性，来实现将多聚泛素蛋白偶联至IFT列车这一关键功能？

2025年8月2 0 日，来自美国哈佛医学院的Alan Brown团队在 Cell 杂志发表了 文章

A conserved mechanism for the retrieval of polyubiquitinated proteins from cilia

研究人员最初的假设是：任何专门负责与多聚泛素化蛋白偶联的桥接蛋白都应与IFT机器协同演化，并普遍存在于各类纤毛生物中。为此，研究人员选择了两种单细胞生物 C. reinhardtii 和 Leishmania tarentolae 作为研究对象，并从两种生物里分离到了高纯度的鞭毛样本提取物。两种生物的鞭毛提取物分别与K48-和K63-连接的多聚泛素链共孵育，通过链霉素包被的beads进行富集、纯化和质谱鉴定。结果显示， C. reinhardtii 样本中有36个蛋白能够同时与K48-和K63-连接的多聚泛素链结合，而 L. tarentolae 中则有54个蛋白同时与K48-和K63-连接的多聚泛素链结合，在两个结合蛋白列表中出现了3个相同的蛋白：CFAP36、TOM1L2和USP5。其中，TOM1L2已经证实和IFT列车转运相关，而USP5是一个非纤毛特异性的去泛素化酶，不太可能与多聚泛素化蛋白维持相互作用并促进IFT转运功能，因此，研究人员的目标集中于功能未知的CFAP36蛋白，推测它可能在纤毛功能维持中发挥关键作用。

早先对CFAP36的唯一认知是，其N端含有一个BART样结构域，能够高亲和性的和小GTP酶蛋白ARL3结合，而ARL3与纤毛IFT列车转运功能密切相关。因此，在本研究中，研究人员首先检测了CFAP36与ARL3的相互作用。结果显示，当添加GTP时，K48/K63-连接的多聚泛素链都能从 L. tarentolae 鞭毛样本中pull-down下ARL3蛋白。体外实验同样证实了上述结论，同时也证明CFAP36能够结合多聚泛素链，而GTP结合的ARL3能够促进上述蛋白质的结合。

接下来，研究人员探究了CFAP36与多聚泛素链结合的分子机制。结构域分析显示CFAP36的α7螺旋中存在两个潜在的泛素结合基序（ubiquitin-interacting motifs, UIMs），ScanNet预测UIM-1可能是一个蛋白结合结构域，而AlphaFold2则预测UIM-1是CFAP36、ARL3和泛素链的三聚复合物结合结构域，另外，AlphaFold2同样预测了α6中同样存在泛素的结合位点，虽然α6中并不存在UIM基序。为此，研究人员分别在上述结构域中进行了关键位点氨基酸突变，并通过免疫共沉淀实验进行检测。结果显示，UIM-2中氨基酸位点的突变并不影响CFAP36和K36-连接多聚泛素链的结合，说明UIM-2并不是泛素链结合所需的结构域。而UIM-1中的S163E突变以及α6中A123E突变都能完全抑制CFAP36和K36-连接多聚泛素链的结合，说明这两个结构域是CFAP36结合多聚泛素链的关键结构域。

之后，研究人员利用ARL3-GTP能够增强CFAP36与泛素链的结合以及S163E抑制其结合的特征通过pull-down实验探究了CFAP36结合多聚泛素链的其它辅助结合蛋白。研究人员共鉴定了49个潜在蛋白质，其中包含一个泛素蛋白自身，5个E3连接酶，35个膜蛋白，比如EGFR、穿膜ATPases等，这里边大多数都是K63连接多聚泛素链的靶标蛋白。唯一意外的一个蛋白是DUOX2，它包含一个确定的K48-连接多聚泛素链结合位点。

进一步的功能分析显示， Cfap36 基因敲除导致纤毛中K63-连接的多聚泛素链、Hh信号通路蛋白SMO和GPR161积聚增加。SMO激动剂SAG能够增加纤毛中SMO水平但降低GPR161的水平，当敲除 Cfap36 基因后，SAG依然能够促进纤毛中SMO水平增加但却不能抑制GPR161在纤毛中的水平降低，说明Cfap36敲除不影响穿膜蛋白进入纤毛，但影响其从纤毛向外的转运。

研究人员进一步利用TIRF（total internal reflection fluorescence）显微镜观察了 C. reinhardtii 鞭毛中IFT列车的转运，并利用CRISPR-Cas9在CFAP36蛋白的C端插入了一个荧光蛋白mStayGold来标记CFAP36的运动，插入另一个荧光蛋白mScarlet标记IFT-B复合物成员IFT54蛋白。结果显示，CFAP36起始逆向运输并与IFT54共定位。CFAP36-mStayGold的逆向转运轨迹起点并不局限于鞭毛的顶部，而是在鞭毛内的不同位置都可以起始逆向转运。

总之，本研究鉴定了纤毛内一个新的调控泛素结合蛋白转运的新因子CFAP36，在此之前它是一个功能未知的蛋白，本研究确定了CFAP36能够和GTP结合的ARL3蛋白结合并促进纤毛内IFT列车的逆向转运，是纤毛功能维持的关键蛋白，对于纤毛功能的深入理解以及靶向治疗纤毛相关疾病提供了新的思路和靶点。

https://doi.org/10.1016/j.cell.2025.07.043

制版人： 十一

参考文献

1、Mitchison, H.M., and Valente, E.M. (2017). Motile and non-motile cilia in human pathology: from function to phenotypes. J. Pathol. 241, 294–309.

2、Moran, A.L., Louzao-Martinez, L., Norris, D.P., Peters, D.J.M., and Blacque, O.E. (2024). Transport and barrier mechanisms that regulate ciliary compartmentalization and ciliopathies. Nat. Rev. Nephrol. 20, 83–100.

3、Mercey, O., Mukherjee, S., Guichard, P., and Hamel, V. (2024). The molecular architecture of the ciliary transition zones. Curr. Opin. Cell Biol. 88, 102361.

4、Lacey, S.E., Graziadei, A., and Pigino, G. (2024). Extensive structural rearrangement of intraflagellar transport trains underpins bidirectional cargo transport. Cell 187, 4621–4636.e18.

5、Huang, K., Diener, D.R., and Rosenbaum, J.L. (2009). The ubiquitin conjugation system is involved in the disassembly of cilia and flagella. J. Cell Biol. 186, 601–613.

6、Shinde, S.R., Nager, A.R., and Nachury, M.V. (2020). Ubiquitin chains earmark GPCRs for BBSome-mediated removal from cilia. J. Cell Biol. 219, e202003020.

7、Shiba, Y., Katoh, Y., Shiba, T., Yoshino, K., Takatsu, H., Kobayashi, H., Shin, H.-W., Wakatsuki, S., and Nakayama, K. (2004). GAT (GGA and Tom1) Domain Responsible for Ubiquitin Binding and Ubiquitination. J. Biol. Chem. 279, 7105–7111.

8、Shinde, S.R., Mick, D.U., Aoki, E., Rodrigues, R.B., Gygi, S.P., and Nachury, M.V. (2023). The ancestral ESCRT protein TOM1L2 selects ubiquitinated cargoes for retrieval from cilia. Dev. Cell 58, 677–693.e9.

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