《食品科学》：南昌大学李俶教授等：高能流体磨增溶大豆蛋白的作用机制

与动物蛋白相比，植物蛋白因其具有来源广泛、价格低廉、生态友好等优势，受到越来越多消费者追捧。大豆蛋白作为一种常见的植物蛋白，具有良好的营养价值以及多种独特的功能性质，对改善食品的感官和品质有较好作用。蛋白质溶解度是评价其加工价值的一个重要参数。大豆蛋白在生产加工过程中的溶解性较差。

大豆蛋白的常用修饰方法包括物理修饰法、化学修饰法、酶修饰法和生物工程修饰法，其实质是通过改变蛋白质的结构改善蛋白质的理化、功能特性。动态微射流作为一种新型的物理修饰方法，与其他物理修饰方法相比，具有营养成分损失小、加工时间短等优势。但前期大量的研究工作已经清晰地认识到传统微射流技术在改性食品大分子和加工方面的局限。因此本团队基于20余年对动态高压微射流（DHPM）技术的研究基础和DHPM在改性食品大分子方面的大量工作，通过创新微射流的核心技术成功创制了高能流体磨（HEFM）设备（图1），其两大主要部件为三柱塞高压往复泵和高速涡流动能反应腔。本课题组前期的研究则表明HEFM处理豌豆蛋白后，其溶解度能够从16.99%提高到64.28%。由此可知HEFM技术在提高植物蛋白溶解度方面具有较大潜力，其增溶机制值得进一步探究。

南昌大学食品科学与资源挖掘全国重点实验室的朱启铭、陈军、李俶*等以大豆蛋白作为研究对象，探究HEFM对大豆蛋白的增溶效果，并进一步从颗粒特性（粒径、电位和微观结构）和结构变化的角度明晰HEFM增溶大豆蛋白的作用机制，以期提供一种制备高浓高溶大豆蛋白的工业化方法。

1 HEFM处理对大豆蛋白溶解度的影响

蛋白质的溶解度是一项关键的功能特性，它直接影响蛋白溶液的外观以及乳化、发泡等其他功能特性。如图2A所示，当HEFM处理压力为30、60、90、120 MPa时大豆蛋白的溶解度分别为64.40%、73.03%、75.13%和76.97%，较未处理的大豆蛋白（30.76%）提高了1 倍多。图2B为各组大豆蛋白溶液静置1 d后的状态，未经处理的大豆蛋白溶液出现了明显的分层现象，而经HEFM处理后的样品均未分层，表明HEFM技术大大增加了大豆蛋白的溶解度。与大豆蛋白大部分常规改性手段相比，HEFM改性不仅操作简单、耗时短，而且效果更好。基于前期对HEFM改性豌豆蛋白机理的探究可以进行一个关于大豆蛋白改性机理的初步推测，即在HEFM处理过程中大豆蛋白受到强大的剪切、高速冲击、瞬时压降和空化力以及额外热效应的影响，可能改变了其结构（如破坏形貌、减小粒度、蛋白去折叠等），从而达到增溶的目的。

2 HEFM处理对大豆蛋白粒径及其分布的影响

蛋白质悬浮液中胶体颗粒粒径会影响其溶解度，因为它会影响其重力。图3A展示了大豆蛋白粒径分布随压力的变化，未经HEFM处理的大豆蛋白的粒径分布呈现一个宽的单峰，经30 MPa压力处理后，粒径分布曲线左移，呈现亚微米和微米级双峰分布。且随着处理压力的增加，样品的亚微米峰面积逐渐增大，微米峰面积逐渐减小。这一结果表明，HEFM处理有效地将大豆蛋白的颗粒尺寸减小到亚微米级。如图3B所示，随着处理压力的增加（0～120 MPa），D[3,2]从46.53 μm降低到0.48 μm，D[4,3]从94.90 μm降低到3.65 μm。粒径的减小可能会增加蛋白质-水相互作用，这可能是改善大豆蛋白溶解度的原因之一。通过动态光散射进一步表征了大豆蛋白上清液的Z-平均粒径。如图3C所示，随着处理压力的增大，大豆蛋白样品的Z-平均粒径先显著增加后不断减小。对于粒径的显著增加，可能归因于动态光散射在未处理的大豆蛋白上清液中无法检测到大的不溶性聚集体，所以在0 MPa时其显示出较小的Z-平均粒径。而经过HEFM处理后，大的不溶性聚集体转变为可溶性聚集体，因此在30 MPa时大豆蛋白的Z-平均粒径激增。吴佳在使用DHPM处理肌原纤维蛋白时也发现了类似的现象，其认为这可能是因为微射流处理使原本紧紧缠绕的蛋白结构展开，当压力较小时，不足以将蛋白破碎成更小的颗粒，因此其粒径有所增加；而随着压力增大，聚集体结构发生解聚，粒径变小。此外，大豆蛋白的PDI随着处理压力的增加而逐渐降低（图3C）。当压力增加到120 MPa时，PDI达到最低值（0.28），这说明悬浮液中的大豆蛋白颗粒在HEFM处理过程中变得更加均匀。总之，颗粒粒径和PDI的减小可能有助于形成更加稳定的大豆蛋白分散体。

3 HEFM处理对大豆蛋白Zeta电位的影响

Zeta电位用于表示蛋白质溶液的表面电荷和稳定性，Zeta电位的绝对值越大，表明蛋白质分子之间的静电相互作用越强，在溶液中的分散稳定性越好。如图3D所示，经HEFM处理后，不同处理压力下大豆蛋白Zeta电位的绝对值均显著高于未处理组。且随着处理压力上升（0～120 MPa），大豆蛋白电位绝对值从18.40 mV增加到28.03 mV，蛋白质聚集体进一步被破坏，使得更多带电侧链暴露到表面，增强了蛋白质之间的静电斥力，静电斥力越大，不稳定聚集的现象越不容易发生，从而提高了蛋白质的稳定性。Cheng Miaomiao等也发现了类似的结论，其研究结果表明DHPM处理的燕麦分离蛋白电位的绝对值显著上升，且随着压力的增大而继续上升，燕麦分离蛋白分散体系趋于稳定。

4 HEFM处理对大豆蛋白微观形貌的影响

为了探究HEFM处理对大豆蛋白微观形貌的影响，通过扫描电子显微镜观察其处理前后的微观形貌（图4）。未处理的大豆蛋白主要呈现为大的聚集体结构。经过HEFM处理后，大豆蛋白颗粒的形态发生了明显变化。在30 MPa压力下，大豆蛋白聚集体转变为较小的不规则颗粒状结构，60 MPa时能观察到比30 MPa时更小的不规则颗粒状结构。当压力增加到90 MPa时大部分蛋白呈现球形颗粒结构，120 MPa时则能够观察到最小且最均匀的球形颗粒结构。蛋白质形貌从大的聚集体转变为小的球形颗粒，证实了HEFM处理后粒径减小的结果，也与本课题组前期贺小红和陆云峰等的研究结果一致。大豆蛋白的疏松结构为其在分散过程中接触水分子创造了更多的机会，从而促进了其溶解度的增加。

5 HEFM处理对大豆蛋白三级结构的影响

蛋白质内部的芳香族氨基酸可以作为鉴定蛋白质三级结构的指标，常利用内源荧光光谱对特定的色氨酸和酪氨酸进行测定，通过荧光光谱强度及波峰的差异来判断蛋白结构的变化。图5显示了未经处理和HEFM处理大豆蛋白的内源荧光光谱。HEFM处理使大豆蛋白的最大吸收波长（λmax）轻微蓝移，表明大豆蛋白所处环境由亲水性向相对疏水性转变。这可能是因为高压破坏了蛋白质内部的疏水相互作用，并使疏水氨基残基暴露到蛋白质表面。先前的研究也得到了类似的结论，Shen Lan等先将大豆蛋白在95 ℃进行预热，再进行微流化处理，同样观察到了大豆蛋白λmax的蓝移，蓝移现象可能表明微流化诱导了大豆蛋白的构象重排。此外，使用HEFM对大豆蛋白进行处理后，其荧光信号的峰值强度显著增加。由图5可以清晰地看出在30～120 MPa的处理压力范围内，随着压力的增大，荧光强度逐步增加。这是由于在天然蛋白质中，能产生荧光的芳香族氨基酸被非极性氨基酸包裹，位于分子内部，而随着处理压力的升高，蛋白结构进一步展开，处于分子内部的芳香族氨基酸逐渐暴露，更多暴露的芳香族氨基酸将促进分子间疏水相互作用和聚集体的形成而导致水溶性蛋白荧光强度增加。

6 HEFM处理对大豆蛋白表面疏水性的影响

将蛋白质与ANS混合，蛋白质中暴露的疏水基团会与荧光探针相结合，使荧光强度发生变化。在极性环境中，蛋白质表面疏水基团的数量用于表征蛋白质的表面疏水性，它是评价蛋白质构象改变的一个指标。从图6可以看出，未经处理大豆蛋白的表面疏水性远低于HEFM处理后大豆蛋白的表面疏水性。且随着处理压力的增大，表面疏水性可以由1 559.60增大至7 199.28。贺小红也发现HEFM处理可以显著提高豌豆蛋白的表面疏水性，与未处理的豌豆蛋白相比，120 MPa处理压力下的豌豆蛋白的表面疏水性急剧增加。这可能是因为高压破坏了较大的蛋白质聚集体，从而使蛋白质内部的疏水基团暴露。同样在HEFM协同pH值循环处理大米-豌豆复合蛋白的研究中，陆云峰等发现仅经pH值循环处理的大米-豌豆复合蛋白的表面疏水性为4 025.33，而当使用HEFM协同pH值循环处理复合蛋白时，表面疏水性则增长至6 842.50。由此推断可能是HEFM撞击腔中的物理作用分散了蛋白颗粒，使颗粒变小的同时蛋白结构也更为舒张，促进了蛋白质疏水区域的暴露，从而提高了蛋白的溶解性。

7 HEFM处理对大豆蛋白巯基和二硫键含量的影响

巯基基团和二硫键是大豆蛋白中重要的功能基团，其含量变化可反映蛋白的变性程度，对蛋白质功能性质有关键的影响。图7反映了HEFM处理前后大豆蛋白游离巯基、总巯基和二硫键含量的变化趋势。未经处理的大豆蛋白的游离巯基和总巯基以及二硫键含量分别为18.87、61.57、21.35 μmol/g，经HEFM处理后，其游离巯基、总巯基和二硫键含量总体均呈现上升趋势。这可能是因为HEFM处理引起了大豆蛋白分子构象伸展，内部巯基基团暴露至表面，导致游离巯基和总巯基含量的增加。同时大豆蛋白分子结构变得越来越无序，促进了巯基向二硫键的转化，因此经过HEFM处理后其二硫键含量也显著上升。处理组中，当压力由30 MPa上升到120 MPa过程中，游离巯基含量先略微下降后逐渐上升，二硫键含量则呈现相反的变化趋势。游离巯基含量由21.98 μmol/g略微下降至21.45 μmol/g，然后在处理压力为120 MPa时上升至22.18 μmol/g；而二硫键含量则先由28.08 μmol/g略微上升至28.44 μmol/g，然后在处理压力为120 MPa时下降至26.14 μmol/g。这是因为在低压环境下的剪切和空化作用加剧了蛋白质分子间的碰撞，促进了游离巯基向二硫键的转变。而当压力升高到一定水平时，处理强度足以破坏肽链内部或分子间的二硫键，进而生成新的游离巯基。而总巯基含量则在压力上升过程中先基本保持不变后逐渐降低，这可能是由于随着压力的增大，内部巯基基团逐渐暴露至表面导致了总巯基含量的增加，同时蛋白质颗粒尺寸在逐渐减小，增加了其与氧气的接触面积又会促进巯基的氧化，导致总巯基含量降低。在处理压力不超过90 MPa时，这两种作用处于平衡状态，所以总巯基含量基本保持不变。而当压力继续增大到120 MPa时，由于内部巯基基团的最大化暴露使总巯基含量不再增加或颗粒尺寸的进一步减小导致氧化程度的加剧打破了这两种作用的平衡，故总巯基含量呈现下降趋势。

8 HEFM处理对大豆蛋白二级结构的影响

在圆二色光谱图中，各种二级结构均会表现出其特定的谱线形状。由图8A可以看出，各组大豆蛋白样品的圆二色光谱曲线在222 nm左右都出现了一个负峰，表明它们的二级结构中均存在α-螺旋结构；在192 nm附近出现一个正峰，同时在215 nm附近有一个负凹槽，表明它们的二级结构中均存在β-折叠结构；在199 nm左右出现了一个负峰，表明它们的二级结构中均存在无规卷曲结构；而在205 nm附近出现了一个正峰，则表明它们的二级结构中均存在β-转角结构。由此可知HEFM处理没有改变大豆蛋白二级结构的类型，仅仅造成了不同二级结构含量的变化。因此通过1.3.7节中提及的网站分析处理圆二色光谱相关数据，计算出了HEFM处理前后大豆蛋白各类二级结构相对含量。如图8B所示，未经处理大豆蛋白的α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲相对含量分别为7.93%、36.27%、22.70%和33.10%。当HEFM处理压力增大到120 MPa后，大豆蛋白二级结构由β-折叠向α-螺旋转变，β-折叠相对含量降低到31.23%，α-螺旋相对含量上升到14.73%，β-转角和无规卷曲相对含量则没有显著变化。同样，张媛通过实验发现，与未经过高压均质处理的大豆蛋白相比，经均质处理大豆蛋白的α-螺旋结构含量升高，β-折叠结构含量降低。这说明高压均质处理使大豆蛋白内部氢键结构排列发生改变，构象发生变化，二级结构朝更为亲水的方向转变。涂宗财在研究动态超高压微射流改性对大豆蛋白结构影响的过程中，也得出了类似的结论。圆二色光谱检测的结果显示经动态超高压微射流处理后，大豆蛋白的α-螺旋相对含量明显增加，β-折叠与无规卷曲相对含量普遍降低，而β-转角相对含量则基本上没有变化。从大豆蛋白二级结构的上述变化来看，动态超高压微射流的作用使原有维系其螺旋结构的稳定性的氢键取向发生改变，削弱了蛋白质的刚性结构，使其稳定性降低，结构更为松散。上述实验结果也与溶解度变化趋势相互印证，表明HEFM处理会使得蛋白二级结构发生转变，有利于蛋白溶解性的改善。

9 SDS-PAGE分析

在还原和非还原条件下，对HEFM处理前后的大豆蛋白进行SDS-PAGE分析，探究HEFM处理对蛋白质一级结构与蛋白质聚集体形成的影响。根据超速离心法中蛋白质沉降系数不同可将大豆蛋白分为2S、7S、11S和15S 4 个不同组分，其中7S和11S所占比例较大。β-伴大豆球蛋白是7S蛋白的主要成分，由α、α′、β 3 种亚基组成。而大豆球蛋白则为11S蛋白的主要成分，由酸性肽链A和碱性肽链B组成。图9A为非还原条件下的电泳结果，反映了原始蛋白中的蛋白质与亚基情况。未经处理的大豆蛋白在约17、35、45、50～75 kDa处存在条带，表明其上清液中存在部分低分子质量的7S和11S蛋白质亚基单体。经过HEFM处理后，电泳条带颜色变深，这是因为更多的大豆蛋白小分子进入泳道中，表明HEFM处理能够破坏大豆蛋白聚集体间的二硫键，进而提升其溶解度。在还原条件下，大豆蛋白聚集体被解聚成相应的亚基，一般来说具有较低分子质量亚单位的蛋白质具有较高的溶解性，如图9B所示，HEFM处理后大豆蛋白的α、α′亚基和酸性亚基A条带颜色变浅，β亚基和碱性亚基B条带颜色变深，表明大豆蛋白低分子质量亚基含量增加，甚至在120 MPa处理条件下大豆蛋白的所有亚基条带颜色均变浅，说明随着压力进一步提升又形成了分子质量更低的亚基单位。上述结果则进一步解释了大豆蛋白溶解性提升的原因。

10 HEFM增溶大豆蛋白作用机制推断

基于上述研究结果，分别从以下2 个层面对HEFM增溶大豆蛋白的作用机制进行推断，如图10所示。首先从宏观层面上来看，商业大豆蛋白在生产过程中通常伴随着极端的加工条件，导致其严重变性，蛋白质会发生高度聚集，进而形成大的不溶性聚集体。而通过扫描电子显微镜和粒径测定的结果可以很直观地看出HEFM处理能够使大豆蛋白不溶性聚集体分散破碎，且随着压力的增大，粒径不断减小，蛋白质形貌转变为小且均一的球形颗粒，增大了蛋白与水的接触面积，从而增强了水-蛋白质相互作用的能力，以达到增溶的效果。其次从微观层面上来看，通过对经HEFM处理的大豆蛋白的SDSPAGE结果进行分析，发现当压力达到一定程度时，大豆蛋白的分子间就会出现解聚集现象，具体表现为分子质量的降低和亚基的降解，此时基于圆二色光谱的实验结果推断出蛋白质分子中的氢键等分子间相互作用被破坏，从而削弱了蛋白质的刚性结构，使其稳定性降低，结构变的较为松散。随着压力的进一步增加，内源荧光数据显示高压破坏了蛋白质分子内部疏水相互作用，结合表面疏水性和巯基相关数据可知原先埋藏于蛋白质分子内部的极性基团（巯基等）和非极性基团（疏水基团等）暴露出来，一方面蛋白质分子颗粒的表面电荷分布加强，蛋白间静电斥力增加，对蛋白颗粒起到了一定的抗聚集作用，这与电位测定结果一致；另一方面，围绕着新暴露的极性基团的结合水增多，蛋白质的水化作用增强。在这两种作用的共同影响下，大豆蛋白的溶解性得到显著提升。

结论

本研究采用HEFM在不同压力下处理大豆蛋白，结果发现HEFM处理显著提高了大豆蛋白的溶解性，HEFM压力越高，大豆蛋白的溶解性越高，最高可以达到76.97%。改性后大豆蛋白的粒径分布左移，Z-平均粒径和PDI下降，电位绝对值增大，说明大豆蛋白分散体系趋于稳定。且随着处理压力的增大，大豆蛋白的电泳条带褪色、荧光强度增大、表面疏水性增加、游离巯基含量上升且分子内（间）二硫键被打断，二级结构向α-螺旋转变，说明HEFM能够破坏大豆蛋白的原有结构并使其发生重排，具体表现为其刚性结构减少，柔性结构增加，分子由有序结构变为无序。分子结构的展开与失稳更加有利于不溶性蛋白聚集体解离为可溶性的蛋白颗粒，从而改善大豆蛋白的溶解度。综上所述，HEFM可以有效地提高商品豆类蛋白质的溶解性，是一种高效的工业化技术，有利于扩大商品豆类蛋白在食品行业中的应用。

作者简介

通信作者：

李俶 教授

南昌大学食品学院

南昌大学食品学院，教授，博士。

研究方向：天然产物的分离纯化，多酚的结构与活性、蛋白质与活性小分子间相互作用。科研成果：近5年来，主持国家自然科学基金3 项。作为主要参与人获江西省科学技术进步一等奖1 项，在国内外核心期刊发表30余篇文章。开展了江西省地方资源南酸枣的研究，在南酸枣的研究方面，处于国际领先水平，在南酸枣天然产物研究方面发表了10余篇论文。近年来，在多酚的结构与活性以及蛋白质与活性小分子相互作用研究中取得一定的成果。

第一作者：

朱启铭 硕士研究生

南昌大学食品学院

2022-2025年于南昌大学食品学院就读硕士研究生。研究方向：植物蛋白改性。

本文《高能流体磨增溶大豆蛋白的作用机制》来源于《食品科学》2025年46卷第8期16-24页，作者：朱启铭，陈军，陈巧云，戴涛涛，邓利珍，王乙惠，张文慧，李俶。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20241009-033。点击下方 阅读原文 即可查看文章相关信息。

实习编辑：陈丽先；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

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