FSHW | 磷虾油通过调节G1-期细胞周期阻滞和改变信号通路及良性前列腺增生相关标志物来改善良性前列腺增生

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Introduction

良性前列腺增生（BPH）是60岁以上男性最常见的疾病之一。它是老年男性的第四种最常见诊断。这种疾病是前列腺的非恶性生长，尽管前列腺增生症也会引发下尿路症状和膀胱出口梗阻。这些影响可能会干扰日常生活的活动，导致疾病特异性生活质量的重大损害，并干扰性功能。BPH治疗通常包括手术、激光和药物，但可能导致复发和副作用，如勃起功能障碍、头晕、低血压、疲劳、虚弱、失眠、性功能障碍或前列腺癌。因此，迫切需要开发有效和安全的治疗前列腺肥大的方法。

BPH的发展取决于功能和雄激素信号。睾酮是二氢睾酮（DHT）的生物合成前体。DHT是由睾酮通过5α-还原酶合成的，这是一种高度亲脂性的酶，存在于细胞膜上。DHT与雄激素受体的结合导致了一连串对调节细胞生长的信号因子的形成所必需的事件。在成年前列腺中，DHT和其他雄激素被认为有助于维持细胞增殖和细胞死亡过程之间的内稳态。前列腺细胞的细胞增殖和凋亡是由雄激素依赖的机制调节的，该机制受到DHT与AR结合所诱导的中间体的作用。DHT可能刺激生长因子的产生和分泌，如表皮生长因子（EGF）、角质形成细胞生长因子、胰岛素样生长因子和成纤维细胞生长因子（FGF），所有这些因子都调节细胞增殖。同样地，DHT影响转化生长因子-β的活性，该因子调节细胞凋亡。

因此，5α还原酶的抑制，从而防止睾酮转化为DHT，可能是开发预防或治疗BPH药物的关键目标。各种药理抑制剂5α还原酶，如非那雄胺或度他雄胺，已被用于治疗前列腺增生患者。然而，这些治疗已知具有致命的副作用。在治疗前列腺增生的策略中，对天然产品的研究，如南瓜籽饮食，Serenoa repens和Pygeum africanum，正在积极进行，但对于这些患者，需要更有效的、价格低廉且副作用最小的治疗方法。

哺乳动物细胞通过细胞周期增殖。因此，细胞周期阻滞是抑制前列腺细胞增殖的关键步骤。细胞周期调节分裂和复制，分为G0/G1、S和G2/M阶段。G0是一个休息阶段，G1是DNA复制前的复制准备阶段，S阶段是DNA合成阶段，G2是DNA复制后的有丝分裂的准备阶段，而M期是有丝分裂阶段。真核细胞的细胞周期始于G1阶段。动物细胞的增殖激活细胞周期蛋白的表达及其与细胞周期蛋白依赖性激酶（CDKs）的结合。细胞周期的进展是由于细胞周期调节剂（如CDKs、周期素和CDK抑制剂（CDKIs））在G1-到S期过渡期间发生的系统性变化。

磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/α-丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（AKT）信号通路在生理和病理条件下对细胞生长和存活起着重要作用。关于细胞存活，AKT可以灭活诱导表达促凋亡因子的转录因子，如Bcl-2相关死亡促进剂、促Caspase-9和其他促凋亡因子，如Fas配体。AKT活性与细胞对由凋亡诱导配体2（APO-2L）介导的细胞凋亡的抗性增加有关，该配体也称为肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）。最后，AKT还激活了NF-κB（IκB）激酶（IKK）的抑制剂，该抑制剂是生存NF-κB的积极调节剂。

丝裂素活化蛋白激酶（MAPK）是α-丝氨酸/苏氨酸激酶，在刺激时对丝氨酸和/或苏氨酸残基的特异性底物进行磷酸化。MAPK信号通路在多重压力环境下调节基因表达、有丝分裂、增殖和细胞凋亡。MAPKs由三个家族成员组成，包括细胞外信号调节激酶（ERK）、c-Jun N-末端激酶（JNK）和p38。ERK蛋白在刺激细胞增殖中起着核心作用。ERK（ERK1和ERK2）的两个异构体无处不在，代表了来自不同受体阵列的有丝分裂信号的汇聚点。p38家族参与某些细胞类型的细胞凋亡激活。JNK蛋白参与正负细胞周期调控途径，以响应各种细胞外刺激。

南极磷虾（Euphausia superba）是一种在南极洲极地海域发现的甲壳类动物，其生物量估计为3.79亿吨。磷虾是一种可持续的ω-3多不饱和脂肪酸（n-3 PUFA）来源，其中含有二十碳四烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA），2种特别长的多不饱和脂肪酸。磷虾油（KO）由与磷脂结合的脂肪酸组成，主要是磷脂酰胆碱。KO是各种活性生物分子的来源，如虾青素、类黄酮、维生素A和α-亚油酸。此外，与鱼油相比，KO具有更好的生物利用度。KO因其丰富的生物量和营养物质、良好的生物利用率以及来自极地相对清洁的环境源而成为引人注目的营养资源。KO已被发现可以抑制巨噬细胞细胞和结直肠癌细胞的NF-κB活性、EGF受体（EGFR）和细胞周期蛋白D1。BPH受高脂血症、氧化和炎症的影响。此外，KO表现出许多生理活性，包括抗高脂血症、抗炎、抗氧化和抗癌作用。

在先前的研究中，通过酶水解提取的KO表现出包括长链PUFA的化学成分谱，并对膀胱癌表现出有效的抗肿瘤效果，没有不良的毒性作用在体外和在体内。然而，KO对前列腺增生症的抑制作用尚未被研究。因此，在本研究中，研究了KO对BPH的分子效应在体外和在体内。

Results

KO对WPMY-1和BPH-1细胞增殖的抑制作用

为研究KO对WP MY-1和BPH-1细胞增殖的抑制作用，分别用KO（0、100、150和200 μg/mL）处理细胞24 h，用MTT法和细胞计数法观察细胞增殖情况。在检查的最高浓度的KO下，WPMY-1和BPH-1细胞的存活率下降到47%和58%，这是通过MTT法评估的（图1A）。在细胞计数测定结果中也观察到了类似的模式（图1B）。在MTT和细胞计数测定中，当细胞用KO处理时，细胞增殖显著减少。

图1 KO对人前列腺细胞WPMY-1和BPH-1增殖的影响

WPMY-1和BPH-1细胞中G0/G1期的被捕获细胞周期

为了研究KO对细胞周期分布的影响，WPMY-1和BPH-1细胞分别用KO处理24 h，然后进行细胞周期分析。结果表明，KO处理（0、100、150和200 μg/mL）显著增加了G1阶段细胞（47.4%、47.7%、50.0%和57.6%）的比例，并减少了WPMY-1细胞中G2/M阶段细胞（31.6%、32.4%、31.2%和24.8%）的比例（图2A和C）。KO处理的BPH-1细胞（在0、100、150和200 μg/mL的KO）在G0/G1阶段（48.9%、51.1%、53.6%和59.5%）显示出细胞群体的积累，并且在G2/M阶段（35.8%，34.3%，32.6%和27.5%）细胞群体数量下降。（图2B和D）。在两种细胞类型中，S相细胞的百分比不受KO处理的影响（图2A-D）。这些结果表明，KO刺激细胞周期在G0/G1在WPMY-1和BPH-1细胞中停滞。

图2 KO在WPMY-1和BPH-1细胞中诱导细胞周期在G0/G1阶段停滞

KO调节WPMY-1和BPH-1细胞中细胞周期相关蛋白标志物的表达

为了确定KO在WPMY-1和BPH-1细胞系中调节细胞周期的机制，使用免疫印迹分析研究了G0/G1阶段相关蛋白标记物的表达，如CDKs、细胞周期素、p21、p27和p53。在KO处理的WPMY-1细胞中，CDK2、CDK4、周期蛋白D1和周期蛋白E的表达水平降低，p21的表达水平增加，而p27和p53的水平没有变化（图3A和B）。与WPMY-1细胞相反，在KO处理的BPH-1细胞中，CDK2和周期蛋白E的表达水平下降，但CDK4和周期蛋白D1的表达水平没有降低（图3A）。此外，KO治疗诱导了BPH-1细胞中p21和p27的表达水平（图3B）。然而，在KO在场的情况下，p53级别没有改变（图3B）。结果表明，KO治疗通过诱导前列腺细胞中p21和p27的表达，调节CDKs和细胞周期蛋白，导致细胞周期在G0/G1阶段停滞。

图3 KO处理后WPMY和BPH-1细胞中G0/G1细胞周期调节蛋白标记物的表达水平

KO上调WPMY-1和BPH-1细胞JNK和p38信号的磷酸化

MAPKs和AKT信号在细胞生长、死亡和细胞分裂中起重要作用。因此，研究了KO处理前列腺细胞中MAPKs和Akt信号的磷酸化水平。KO处理增加了WPMY-1细胞中JNK和p38的磷酸化程度（图4A），但ERK1/2和AKT磷酸化水平保持不变（图4A和B）。从KO处理的BPH-1细胞中也获得了类似的结果（图4A和B）。这些结果表明，KO通过刺激JNK和p38的磷酸化来减少前列腺细胞的增殖。

图4 KO在WPMY-1和BPH-1细胞中诱导了p38和JNK的磷酸化

KO抑制WPMY-1和BPH-1细胞中NF-κB的结合活性

刺激NF-κB的激活参与哺乳动物细胞增殖、分化和信号通路的调节。因此，使用EMSA（图5）。两种细胞都用KO处理24 h，从细胞裂解物中获得核提取物。EMSA结果表明，KO阻断了WPMY-1和BPH-1细胞中NF-κB基序的结合活性。这些结果表明，NF-κB转录激活的减少部分归因于KO诱导的前列腺细胞增殖抑制。

图5 KO处理后的WPMY和BPH-1细胞中NF-κB结合活性的抑制

封锁p38和JNK可消除KO介导的前列腺细胞增殖抑制作用

为了确定p38和JNK信号是否参与了KO诱导的前列腺细胞增殖减少，使用了siRNA特异性的p38（si-p38）和JNK（si-JNK）（图6A）。封锁p38和JNK可防止在KO存在下前列腺细胞增殖减少（图6B）。结果表明，p38和JNK信号可能有助于调节KO介导的前列腺细胞增殖。

图6 通过siRNA敲除p38和JNK抑制了KO介导的前列腺细胞生长抑制

KO调节WPMY-1和BPH-1细胞中BPH相关蛋白标志物的表达水平

为了研究BPH相关蛋白标志物的表达水平，如5α-还原酶、AR、FGF、Bcl-2和Bax，前列腺细胞经过KO处理24小时。免疫印迹结果显示，KO处理降低了WPMY-1和BPH-1细胞中5α-还原酶、AR、EGF和FGF-2蛋白的表达水平（图7A）。此外，在用KO处理的两种细胞类型中，抗凋亡蛋白标志物Bcl-2水平均下降（图7B）。凋亡蛋白标志物Bax的表达水平在KO存在下有所增加（图7B）。这些结果表明，KO诱导的前列腺细胞增殖抑制可能与前列腺肥大标志物表达水平的变化有关

图7 KO处理后WPMY和BPH-1细胞中BPH相关蛋白标志物的表达水平

KO在TE诱导的大鼠模型中阻碍前列腺增生

为了研究体内KO对BPH减少的影响，获得了一个TE刺激的大鼠模型。非那雄胺被用作阳性对照（图8A、D、E）。对照组和KO处理组之间没有观察到显著的BW变化（图8A）。与对照组相比，给予KO的大鼠前列腺大小有所减少（图8B）。KO治疗组的PW/BW指数与对照组相比显著下降（图8C）。此外，通过ELISA法测定各组血清中的DHT量。DHT量相对于总睾酮表达。治疗组的DHT指数以剂量依赖性方式低于对照组（图9A）。此外，非那雄胺组的DHT水平下降幅度最大（图9B）。随后，通过H&E和Ki-67染色对前列腺组织进行组织学分析（图9C）。与对照组相比，KO治疗组的上皮组织和肌层厚度明显减轻（图9C）。KO对TE治疗组前列腺变化的组织学影响与非那雄胺疗效相似（图9C）。这些结果表明，KO减轻了体内TE诱导的前列腺增生。

图8 KO在TE诱导的BPH大鼠模型中的效果

图9 KO对TE诱导的BPH大鼠模型的影响

KO通过改变TE诱导的前列腺增生大鼠模型中前列腺增生的蛋白标志物水平来减少前列腺肥大

使用免疫印迹分析研究了前列腺组织中BPH相关蛋白标志物的表达水平。5α-还原酶、AR、EGF和FGF-2蛋白在KO处理后的组织中的表达水平与对照组相比降低（图10A）。此外，在KO处理的前列腺组织中，Bcl-2水平下降，而Bax水平增加（图10B）。总体而言，体外实验结果与体内相比具有优势。

图10 KO处理后的BPH大鼠模型前列腺组织中BPH相关蛋白标志物的表达水平

Conclusion

总之，KO抑制了WPMY-1和BPH-1细胞的增殖，这与CDKI介导的G0/G1细胞周期阻滞、信号通路失调、NF-κB结合活性降低以及BPH相关分子标志物的调节水平相关。在TE诱导的前列腺增生大鼠模型中，KO的服用抑制了病理性前列腺观察。本研究结果显示了KO对前列腺增生症的有益作用，并为开发治疗或预防前列腺肥大症的新功能性药物提供了有价值的信息。将来需要进行一项临床研究。

Krill oil ameliorates benign prostatic hyperplasia by regulating G1-phase cell cycle arrest and altering signaling pathways and benign prostatic hyperplasia-associated markers

Hoon Kima, Jongyeob Kima, Byungdoo Hwanga, SangYong Parkb, Ji-Yeon Shinb, EunByeol Gob, Jae Sil Kimb, Youngjin Roha, SoonChul Myungc, Seok-Joong Yund, YungHyun Choie, Wun-Jae Kimf, Sung-Kwon Moona,*

a Department of Food and Nutrition, Chung-Ang University, Anseong 17546, Republic of Korea

b SD Biotechnologies, Seoul 07793, Republic of Korea

c Department of Urology, College of Medicine, Chung-Ang University, Seoul 06974, Republic of Korea

d Department of Urology, Chungbuk National University, Chungbuk 361-763, Republic of Korea

e Department of Biochemistry, College of Oriental Medicine, Dongeui University, Busan 47340, Republic of Korea

f Institute of Urotech, Cheongju, Chungcheongbuk-do 361-763, Republic of Korea

*Corresponding author.

Abstract

Krill oil (KO) exhibits various biological activities, such as anti-inflammatory and antitumor effects. However, the inhibitory effects of benign prostatic hyperplasia (BPH) in vitro and in vivo have not yet been studied. This study investigated the anti-BPH effects of KO extracted by an enzymatic hydrolysis method. KO treatment inhibited the proliferation of WMPY-1 and BPH-1 cells by induction of G0/G1 phase arrest through the modulation of positive and negative regulators in both prostate cell types. KO treatment stimulated phosphorylation of c-Jun N-terminal kinase (JNK) and p38 signaling. In addition, KO changed the expression of BPH-related markers (5α-reductase, androgen receptor, FGF, Bcl-2, and Bax) and the activity of the proliferation-mediated NF-κB binding motif. KO-induced levels of proliferation-mediated molecules of prostate cells were attenuated in the presence of siRNA-specific p-38 (si-p38) and JNK (si-JNK). Furthermore, the administration of KO alleviated prostate size and weight and the cell layer thickness of prostate glands in a testosterone enanthate-induced BPH rat model. KO treatment altered the level of dihydrotestosterone in serum and the expression levels of BPH-related markers in prostate tissues. Finally, KO-mediated inhibition of prostatic growth was validated by histological analysis. These results suggest that KO has an inhibitory effect on BPH in prostate cells in vitro and in vivo. Thus, KO might be a potential prophylactic or therapeutic agent for patients with BPH.

Reference:

KIM H, KIM J, HWANG B, et al. Krill oil ameliorates benign prostatic hyperplasia by regulating G1-phase cell cycle arrest and altering signaling pathways and benign prostatic hyperplasia-associated markers[J]. Food Science and Human Wellness, 2024, 13(6): 3311-3324. DOI:10.26599/FSHW.2023.9250017.

翻译： 田雨欣（实习）

编辑：梁安琪；责任编辑：孙勇

封面图片：图虫创意

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