真松弛！师姐细胞房玩手机，实验结果还这么好（有奖调研）

新来的师妹总嘀咕：「师姐经常在细胞房随地大小刷手机，为啥细胞状态还那么好？我全程小心翼翼，却总有污染」？

其实，你看见她「随手」把培养基放回水浴锅，没看见她定时给水浴锅消毒杀菌；你模仿她「快速」换液的操作，却忽略了她提前半小时预热好培养基和 PBS；她喷洒酒精的路径、润洗细胞的角度和力度，都可能是千百次试错打磨出的肌肉记忆。

细胞培养的成败藏在细节里，想拥有师姐同款「细胞房松弛感」？赛业生物联合丁香园诚意推出【细胞培养有奖调研】，1 分钟完成调研即可领取【细胞培养精要指南】资料包，覆盖常见细胞系/原代细胞/间充质干细胞/基因修饰细胞培养方案，全面解析细胞培养痛点难点，助你稳稳拿捏细胞培养！

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1. 如何准确判断你的细胞状态？

① 细胞污染判断

细菌污染：通常表现为培养基变酸，伴随浑浊，有异味，镜下观察有明显自由行动的颗粒或念珠状菌落。

真菌污染：通常倾向于聚集生长，在培养体系内形成「毛茸茸」的菌落，或丝状菌体，但一般不会出现培养基变酸的情况。

支原体污染：大部分没有任何异常情况，培养体系、细胞生长都正常。这时，只能通过 PCR 或市面上专用的检测试剂盒来鉴定。

② 细胞汇合度判断

细胞汇合度达到 80% 时需给细胞传代。密度过大时细胞增殖会出现接触抑制，从而导致细胞老化或者消化过程出现成团的现象。可根据下图确定细胞汇合度：

更多细胞培养技巧可在资料包中《细胞培养常见问题解答》中查看。

2. 原代细胞分离及培养的常见痛点解析

① 原代细胞分离提取中混有的其他细胞怎么去除？

自然纯化：利用某一类细胞的增殖优势，即多种细胞混在一起培养时，其中某一种细胞因对体外环境适应能力强，增殖较快，成为优势生长细胞群，而其他种类细胞所占比例越来越少，从而达到去除其他细胞的目的。但是这种方法无法人为的选择细胞，且优势生长的细胞往往都是成纤维细胞。

人工纯化：人为地创造适合某一种细胞生长的环境，抑制其他细胞生长，从而对混合细胞进行纯化。常用的基本方法有：酶消化法、机械刮除法、反复贴壁法、培养基限定法等。

② 离心后细胞没有分离出来

考虑是否选用了合适的酶、消化时间和分离条件。

不同类型的细胞在离心速度上也有差别。要根据细胞类型选择合适的离心条件，有时候明明已经成功分离出细胞，但是却由于错误的离心条件导致分离失败。

③ 细胞量过少难以继续增殖

如果组织量太少导致细胞量过少，可适当增加组织量。

若因为消化下来的细胞量少，可对没消化完的组织块反复消化，尽量多收集一些细胞。

接种时应选择合适的培养器皿，接种面积不宜过大；若是细胞仍太少，应耐心等待，尽量不要传代，只换液。

更多原代细胞分离及培养的注意事项可在资料包中《细胞培养常见问题解答》中查看。

3. 基因修饰细胞操作注意事项

① 避免基因敲除过程中的蛋白残留

基因一般含有多个不同的转录本，在选择敲除位点时，有时会很难保证覆盖所有的转录本，而未被影响到的转录本就有可能正常转录翻译从而表达出具有部分功能域的蛋白。因此在设计 KO 细胞方案时，应综合考虑数据库基因信息、文献，甚至通过预实验，从而尽可能地覆盖多个转录本。

② 点突变与基因敲入细胞设计 donor 的注事事项

较小的片段（如只是引入标签等）可以使用 ssODN。但是长片段敲入需要用质粒法构建 dsDNA 载体。需要注意的是敲入的片段不能过长，一般不超过 5 kb（包含抗性和荧光筛选），过长会降低重组效率。

突变位点尽量靠近双链 DNA 缺口，以保证同源重组的效率。一般而言，以 ssODN 为 donor 的理想距离是在 10 bp 以内；以质粒为 donor 的理想距离是在 1,000 bp 以内。

同源臂一般选取 1,000～1,500 bp 较为合适。而且在同源臂模板的选择上，同源臂建议以待突变的目的细胞基因组为模板扩增，避免不同细胞基因组差异导致同源臂不同源，降低重组效率。

将引导分子的 PAM 或邻近 PAM 的序列进行同义突变，避免非目的基因突变。

③ 构建稳转株的细胞与载体选择

一般选择可稳定传代的细胞系。

当目的基因和这些载体元件长度小于 6.4 kb 时，一般选择慢病毒载体。

如果序列长度过大，超出慢病毒包装容量，可选择 PiggyBac 载体构建稳转株，转座子载体总容量可达 30 kb。

④ 诱导多能干细胞（iPSC）基因编辑技术难点

iPSC 基因编辑的难点有基因编辑效率低、细胞培养易分化，单克隆形成率低等难点。针对以上难点的解决方案和注意事项有：

选择合适的基因编辑方案至关重要。赛业生物的智能化系统可以对基因进行全面分析，包括致死性、拷贝数和表达水平等多维度评估提升项目成功率。

iPSC 转染困难也会导致基因编辑效率低，建议选择温和转染方法保证效率同时也要确保细胞活率。

iPSC 培养过程中容易分化，需要注意提供合适的培养系统、良好的生长环境、操作轻柔等防止 iPSC 分化。

单克隆形成率低，iPSC 呈克隆团生长，单克隆不易形成，注意选择合适的消化液将 iPSC 克隆团消化成单个细胞，接着选择适合的单克隆制备方案提升单克隆形成率。

更多细胞基因修饰策略及操作技巧可在资料包中《基因修饰细胞系常见问题解答》查看。

4. 如何高效诱导间充质干细胞（MSC）三系分化（以赛业 OriCell® 干细胞诱导分化试剂盒使用为例）

① 成骨诱导

诱导之前包被明胶（0.1% 的明胶溶液），以防止成骨诱导后期细胞出现成片脱落的现象；默认明胶包被时间至少 30 min，如果细胞极易脱落，可以过夜包被。

诱导起始点：细胞汇合度达到65%～70%时开始换用诱导液。

诱导每 2～3 天进行换液时动作需轻柔，培养基沿六孔板壁加入，以防止已形成的钙结节被冲刷掉。

建议看到较多钙结节沉积的情况下再染色，不要着急染色，以免诱导前功尽弃。

固定时间为30 min即可，不宜太长。

茜素红染色时间控制在 5 min 左右，如果染色效果较浅可以适当延长时间。

② 成脂诱导

为减少诱导过程细胞漂起、不贴壁，建议使用明胶包被培养容器。

诱导培养基在使用前均需预热至 37 °C。

当细胞汇合度达到 100% 时开始换用诱导液。

A 液刺激脂滴形成；B 液维持已形成的脂滴，并促进脂滴增大。通常情况下，按照「A 液 3 天，B 液 1 天」的使用方式即可顺利诱导细胞成脂

A 液和 B 液交替使用，期间需每天观察细胞状态。若在 A 液诱导过程中出现细胞收缩、死亡的情况，请及时更换为 B 液，直至细胞状态恢复。

为防止脂滴脱落，所有操作尽可能轻缓。最后染色时油红 0 需要按照 3 : 2（油红 0 : 蒸馏水）进行稀释并用中性滤纸过滤或离心之后方可使用。

③ 成软骨诱导

吸取添加物 II 之前需短暂离心试剂管，使试剂聚集于管底以便取用。

务必将添加物 II 分装保存在 -20 ℃ 以下，避免反复冻融，可保存 12 个月。

加入添加物 II 的成软骨诱导分化完全培养基务必现配现用，4 °C 保存不可超过 12 h。

培养过程中要拧松离心管盖以便于气体交换，不需要吸去上清或重悬细胞；24 h 之内不要晃动离心管。

当细胞团出现聚团现象时（一般为 24 h 或 48 h 后，视实际情况而定），轻弹离心管底部使软骨球脱离管底悬浮在液体中。

自接种开始计算，每隔 2～3 d 给细胞换用新鲜的成软骨诱导分化完全培养基。

每次更换培养基后，都需轻弹离心管，使软骨球脱离管底悬浮在液体中；且更换培养基后务必拧松离心管盖再放入培养箱中。

持续诱导至管内形成直径 1.5～2 mm 的软骨球，即可准备切片染色。

更多间充质干细胞三系分化诱导操作方法、常见问题解读可在资料包中《间充质干细胞分化诱导一本通》查看

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内容策划：王丹琦

内容审核：李琳

题图来源：自己做的