Science丨类器官重建人类中线组织揭示轴突引导关键因子

撰文|易

在神经系统发育过程中，神经组织的空间图谱建立和轴突的精确导航是形成正常神经网络连接的关键。位于神经管腹侧正中线的基板（ floor plate,FP）是一种重要的组织中心，通过分泌形态发生素和轴突导航信号，指导神经细胞的分化和轴突越过中线建立双侧连接。虽然小鼠等非人类模型在 FP 功能的研究中发挥了重要作用，但由于物种之间的发育差异，这些模型难以完整还原人类特异的中线组织和轴突引导机制。因此，开发人源性的FP模型，有望揭示人类神经发育中独特的信号调控机制，并为相关神经发育疾病的研究奠定基础。近年来，干细胞衍生的脑类器官和类组织为模拟人脑复杂的细胞间相互作用提供了新工具，但目前尚缺乏可用于研究人类 FP 组织功能及中线轴突引导的成熟模型。

近日，美国斯坦福大学Sergiu P. Pașca团队在 Science 期刊上发表题为

Midline assembloids reveal regulators of human axon guidance

首先从人诱导多能干细胞（ hiPSCs ）出发，通过模拟脊索诱导信号的分子组合诱导形成富含 FOXA2 表达的 FP 类器官 hFpOs ，并通过单细胞转录组测序验证其基因表达谱与人类脊髓发育数据库中 FP 区域相匹配。同时，通过不添加 SHH 途径激动剂的方法获得背侧化的人类脊髓类器官 hSpOs ，未腹侧化的 hSpOs 主要表达背侧标志基因 PAX6 与 PAX3 ，不表达 FOXA2 。随后，将 hFpOs 与不同发育阶段的 hSpOs 在超低附着微孔板中组装，构建出人类中线类组织（ hMAs ），以模拟 FP 诱导下的腹侧神经组织模式化和轴突导航。

在轴突引导实验中，在晚期（第 22 天）未腹侧化的 hSpOs 中诱导出多个背侧中间神经元亚型，包括 dI1–dI5 亚群，并识别出表达 ROBO3 和 DCC 的投射性神经元。当这些 hSpOs 与第 8 天的 hFpOs 组装时， ROBO3 阳性的轴突展现出向 hFpO 方向有序生长和集束现象，而与非 FP 类器官组装时则仅有稀疏且无方向性的投射，提示 hFpOs 能诱导人类轴突向中线投射。

其次， 为研究轴突的中线穿越和双侧连接， 作者 进一步建立三腔体的 hMAs 结构，即在两个 hSpOs 之间插入一个 hFpO 。通过表达 eYFP 和钙离子感应蛋白（ GCaMP8s ）标记轴突投射与神经活动，并利用光遗传学操控 hSpOs 的神经放电。在构建的三腔体 hMAs 中，轴突不仅进入 hFpOs ，还可成功穿越中线投射至对侧 hSpO 。在标记双侧 hSpOs 的 GCaMP8s 实验中，观测到两个 hSpOs 之间出现高度同步的钙信号活动，表明已建立双侧功能连接。此外，通过光遗传激活一侧 hSpO ，能在对侧诱导稳健的神经放电活动，且这种活动依赖于谷氨酸受体信号通路，进一步证明 hFpOs 在促进中线穿越和双侧突触连接中的关键作用。

为了系统寻找调控人类 FP 介导轴突导航的关键分子， 作者 首先采用液相色谱 - 质谱联用技术（ LC-MS ）分析 hFpO 的分泌组，检测到 1876 种分泌 / 膜蛋白，结合人类 FP 特异性表达数据库和物种差异分析，筛选出 27 个人类富集候选基因。随后，在 CRISPR 筛选中，敲除 NTN1 和 SPON1 抑制了 ROBO3 阳性轴突的进入，验证其保守功能。而在人 - 鼠表达差异较大的基因中，敲除 GALNT2 和 PLD3 也显著减少了轴突投射，提示其在人类 FP 中的新功能。进一步发现， GALNT2 的缺失影响了 FP 样细胞的腹侧身份标志（如 FOXA2 、 NKX2.2 ）的表达，而 PLD3 敲除则不影响 FP 身份，说明 GALNT2 可能还调控了 FP 的身份维持。

综上所述，本研究开发了类似人类FP的类器官（hFpOs），并将其与人类脊髓类器官（hSpOs）组装，生成中线类组织（hMAs）。研究证实， hFpOs 能够有效促进腹侧模式化形成、引导联合轴突生长并建立双侧神经连接。通过分泌组学分析，鉴定出 27 个在人类中富集的基因（相较于小鼠模型）。进一步利用排列式 CRISPR 筛选技术对 hMAs 进行研究，发现 GALNT2 和 PLD3 基因的缺失会显著损害 FP 介导的轴突引导功能。这一创新性研究平台为揭示人类特有的神经发育机制及相关疾病病理提供了重要工具。

https://www.science.org/doi/10.1126/science.adq7934

制版人： 十一

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