技术梳理系列 | Genmab的Duomab平台

DuoBody®是一种多功能的生物技术平台，用于生成双特异性抗体，这些抗体能够产生多种效果，包括同时招募免疫细胞和识别肿瘤细胞。

双特异性抗体为多种双重靶向应用提供了一种灵活的解决方案。它们可用于细胞受体的阻断、激活或下调；可用于招募并靶向T细胞；还可用于协助递送毒性载荷。

DuoBody®技术平台

Genmab的DuoBody®是一个经过验证的技术平台，用于双特异性抗体库的高通量生成和筛选，采用的是双特异性抗体格式。

DuoBody®平台技术涉及三个基本步骤，用于生成稳定的双特异性人源IgG1抗体。首先，分别生产两个IgG1抗体，每个抗体在第三恒定（CH3）结构域中均含有单一匹配的突变（第409位赖氨酸突变为精氨酸，K409R；第405位苯丙氨酸突变为亮氨酸，F405L），使用重组哺乳动物表达系统进行生产（见下图，步骤1）。随后，根据标准的回收和纯化流程对这些IgG1抗体进行纯化（见下图，步骤2）。生产并纯化后，在特定的实验室条件下将两种抗体重新组合，这一过程称为Controlled Fab-arm exchange，最终以非常高的产量（通常>95%）获得双特异性抗体产品（见下图，步骤3以及生产示意图）。

DuoBody®生产工艺：生成双特异性抗体的3个步骤。

通过cFAE生产双特异性抗体示意图.图片来源：doi:10.1038/nprot.2014.169

DuoBody®工艺既可以在发现规模上轻松进行，也可以扩展到商业生产规模（见下图）。

DuoBody®平台采用的简单后生产交换反应，可用于生成双特异性抗体库。X和Y代表抗体库。X+Y是需要进行的生产次数，而X×Y是在发现过程中生成的不同双特异性组合的数量。

如有需要，可以采用简单的精制步骤来获得本质上纯净的DuoBody®产品。重要的是，通过DuoBody®平台生成的双特异性抗体完全保留了IgG1的结构和功能（见下图）。

数据来源：doi/10.1073/pnas.1220145110

此外，DuoBody®平台还兼容额外的Fc工程突变，以满足特定应用的需求。DuoBody®平台的便捷性和多功能性也已扩展到小鼠（和大鼠）抗体，从而可以通过Controlled Fab-arm exchange高效生成替代性的双特异性小鼠IgG1、IgG2a和IgG2b（以及大鼠IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG2c分子）（见下图）。

数据来源：DOI:10.1038/s41598-017-02823-9

DuoBody®平台的生物学意义

DuoBody®平台基于对抗体自然生物学的深入理解，旨在创造创新的治疗方法。

DuoBody®平台的灵感来源于对IgG4 Fab臂交换这一自然发生过程的广泛了解。要理解Fab臂交换的过程，回顾人免疫球蛋白G（IgG）抗体的结构组成至关重要。人IgG抗体分为四个亚类：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，它们具有不同的结构和功能特性。大多数IgG亚类是对称的，包含两个相同的抗原结合位点，因此这些抗体是单特异性的（即只能结合一种特定的表位）。人IgG4分子也是由B细胞产生的单特异性抗体。然而，一旦它们被B细胞分泌后，就可以参与一种独特的Fab臂交换过程，在此过程中它们会变成双特异性的。这一动态且随机的过程涉及从一个IgG4抗体中重组Fab臂（由一条重链与一条轻链结合而成），与另一个IgG4抗体的Fab臂进行交换。因此，形成了具有不同抗原特异性的Fab臂的IgG4抗体。

人体内的所有IgG4分子都参与了这种自然发生且持续不断的Fab臂交换过程。在人类中，能够参与Fab臂交换是IgG4所固有且独特的特性。有趣的是，双特异性抗体因此在人体免疫中自然产生。基于对IgG4 Fab臂交换的机制的广泛研究，发现铰链区和CH3结构域在Fab臂交换中都起着关键作用。更具体地说，铰链区第228位的丝氨酸（S228）和CH3结构域第409位的精氨酸（R409）（见下文）被证实是允许IgG4抗体参与Fab臂交换的关键氨基酸残基。

铰链区第228位的丝氨酸（S228）是允许IgG4抗体参与Fab臂交换的关键氨基酸残基

• 体外实验：在存在GSH的情况下，野生型IgG4（如IgG4-EGFR和natalizumab）发生了Fab臂交换，而含有S228P突变的IgG4（如IgG4S228P-EGFR）则没有发生交换。

IgG4-CD20与IgG4-EGFR（a、f）、IgG4S228P-EGFR（b、g）、natalizumab（c、h）、gemtuzumab（d、i）和TGN1412（e、j）。数据来源：DOI: 10.1038/nbt.1553

• 体内实验：只有含有野生型IgG4分子的混合物（如IgG4-EGFR和natalizumab）在小鼠血液中产生了双特异性抗体，而含有S228P突变的IgG4（如IgG4S228P-EGFR）或IgG1分子的混合物则没有产生双特异性抗体。

IgG4-CD20/IgG4-EGFR（开放圆圈）、IgG4-CD20/IgG1-EGFR（开放正方形）、IgG4-CD20/IgG4S228P-EGFR（闭合圆圈）、IgG4-CD20/natalizumab（闭合正方形）和IgG4-CD20/gemtuzumab（闭合三角形）。数据来源：DOI: 10.1038/nbt.1553

• 药代动力学模型中的S228P突变：S228P突变通过稳定核心铰链区，显著减少了治疗性IgG4抗体与内源性IgG4之间的Fab臂交换，从而提高了药物的稳定性和安全性。

数据来源：DOI: 10.1038/nbt.1553

CH3结构域第409位的精氨酸（R409）是人类 IgG4 发生 Fab 臂交换的关键 CH3 决定因素

• 解离常数（KD）：通过CH3-CH3相互作用的KD值看出，IgG4的KD值约为4.8×10^-8 M，而IgG4-R409K的KD值约为8.0×10^-9 M，表明R409K突变显著增强了CH3-CH3的相互作用。只有当CH3–CH3相互作用足够弱时，才会发生高效的Fab臂交换。

数据来源：DOI: 10.4049/jimmunol.1003336

• Fab臂交换效率：在体外实验中，野生型IgG4在24小时内可达到约50%的双特异性抗体生成效率，而R409K突变体则无法检测到双特异性抗体的生成。

数据来源：DOI: 10.4049/jimmunol.1003336

• 体内实验结果：在小鼠模型中，注射IgG4-EGFR和IgG4-CD20混合物后，3小时即可检测到双特异性抗体，24小时达到峰值，表明IgG4在体内也能发生Fab臂交换。

基于以上对IgG4 Fab臂交换机制的深入理解，Genmab开发出了用于生成稳定双特异性IgG1抗体的强大平台：DuoBody®平台。

自主思考时间

IgG4的Hinge区的S228和CH3结构域的R409与IgG1的结构差异？

Hinge区：IgG1的铰链区在第228位为脯氨酸（P228），其环状结构限制了多肽链主链的自由旋转，赋予了铰链区更高的刚性和稳定性，从而限制了二硫键的灵活性，使得IgG1铰链区结构更为稳固。相比之下，IgG4在该位点为丝氨酸（S228），其较小且极性的侧链使铰链区更加灵活，易于发生链间二硫键的解离和重组，进而促进Fab臂的交换。因此，IgG1抗体由于P228带来的刚性结构特点，表现出更高的稳定性且不会发生Fab臂交换，更适合用于开发稳定的单特异性抗体药物。

CH3结构域：在IgG的CH3结构域中，重链界面之间存在着多种非共价相互作用力，包括疏水作用（例如F405、L368、V397等形成的疏水核心）、氢键（例如谷氨酰胺Q347、苏氨酸T366等构成的氢键网络）以及静电相互作用。IgG1的CH3结构域在409位为赖氨酸（K409），通过稳定的静电相互作用增强了CH3结构域界面的紧密结合；而IgG4的409位为精氨酸（R409），其较长且带正电荷的侧链增加了CH3结构域界面间的静电排斥，破坏了界面的稳定性，从而促进了IgG4 Fab臂交换的发生。

基于Genmab的Duobody平台上市的双特异性抗体药物

Teclistamab（商品名：Tecvayli®）

原研单位：强生公司（Johnson&Johnson）

靶点：BCMA和CD3。

BCMA：B细胞成熟抗原，主要在恶性浆细胞和正常浆细胞中高表达，是治疗多发性骨髓瘤的重要靶点。

CD3：T细胞表面的膜抗原，与T细胞抗原识别受体（TCR）结合，激活T细胞，实现T细胞重定向。

上市时间

• 欧盟：2022年8月25日。

• 美国：2022年10月25日。

• 中国：2024年6月18日。

适应症：Teclistamab主要用于治疗复发或难治性多发性骨髓瘤（R/R MM）成人患者。

Epcoritamab（Epkinly®）

原研单位：艾伯维与Genmab达成协议，共同开发和商业化epcoritamab。

靶点：CD20和CD3

CD20（B细胞表面抗原CD20）主要在成熟B细胞上表达，调控其激活、分化和增殖，并参与B细胞受体（BCR）信号通路的调控，是B细胞淋巴瘤和白血病等恶性肿瘤的重要治疗靶点，而在前B细胞和浆细胞上则不表达。

上市时间

• 美国：2023年5月19日，FDA批准Epcoritamab（Epkinly）上市。

• 日本：2023年9月，Epcoritamab在日本获批。

• 欧洲：2023年9月，Epcoritamab在欧洲EMA获批。

适应症

Epcoritamab在美国、日本和欧洲均获批用于治疗接受过两线及以上系统治疗后复发或难治性的弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）及相关亚型患者，其中美国还批准其用于滤泡性淋巴瘤（FL）患者。

Amivantamab（Rybrevant®）

原研单位：杨森生物（Janssen Biotech，强生公司旗下）与Genmab合作开发。

靶点：EGFR和c-MET。

EGFR（表皮生长因子受体）：是一种酪氨酸激酶受体，广泛表达于多种细胞类型中，参与细胞增殖、分化和存活等生物学过程。在多种癌症（如肺癌、结直肠癌等）中，EGFR基因突变会导致其异常激活，从而促进肿瘤细胞的生长和存活。

c-MET（间充质上皮转化因子）：是一种受体酪氨酸激酶，参与细胞增殖、迁移和存活等过程。c-MET基因的异常激活（如扩增、突变或过表达）在多种癌症（如肺癌、胃癌、肝癌等）中较为常见，与肿瘤的侵袭性和预后不良密切相关。

上市时间

• 2021年5月21日，美国FDA批准Amivantamab（商品名Rybrevant）上市。

• 2025年2月，Amivantamab在中国获批上市。

适应症

Amivantamab主要用于治疗携带EGFR外显子20插入突变或EGFR exon19del/L858R突变的局部晚期或转移性非小细胞肺癌（NSCLC）患者，包括单药治疗经铂类化疗进展的患者，以及联合卡铂和培美曲塞用于一线治疗或特定突变经EGFR-TKI治疗进展的患者。

Talquetamab（Talvey®）

原研单位：强生公司（Johnson&Johnson），由其旗下杨森制药（Janssen Pharmaceuticals）开发。

靶点：GPRC5D和CD3

GPRC5D（G蛋白偶联受体C类5成员D）是一种在多发性骨髓瘤（MM）细胞中高表达的孤儿受体，主要在毛囊等硬角化组织中表达，其激活可促进细胞增殖、生存和迁移，与MM患者的不良预后相关。

上市时间

• 2023年8月：美国FDA加速批准Talquetamab（商品名：Talvey）上市。

• 2023年8月：欧盟委员会有条件批准Talquetamab上市。

• 2024年7月：在韩国获批上市。

• 2025年2月：在中国获批上市。

适应症

Talquetamab获批用于治疗既往接受过至少三线治疗（包括蛋白酶体抑制剂、免疫调节剂和抗CD38抗体）的复发或难治性多发性骨髓瘤（R/R MM）成人患者。

总结

基于Genmab的Duobody平台开发的双特异性抗体药物在肿瘤治疗领域取得了显著进展，已有4款药物获得FDA批准上市，分别针对不同的肿瘤靶点，为患者提供了新的治疗选择。

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