eLife丨金大勇团队揭示细菌耐药性快速进化的新机制

细菌耐药性已成为全球公共健康面临的重大挑战，其中一个核心问题是细菌如何在抗生素压力下迅速进化出耐药表型。传统认识认为，抗生素通过其特定的作用靶点发挥杀菌作用，但越来越多的研究表明，抗生素还可能通过诱导DNA损伤和活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）产生，触发细菌的一系列应激反应【1】。

在这些应激反应中，SOS反应是一种经典的DNA损伤修复机制，依赖于recA基因的激活。该过程可以启动多条DNA修复通路，帮助细菌在抗生素压力下生存【2】。然而，SOS反应也可能带来“双刃剑”效应：一方面，DNA损伤本身可能导致突变累积；另一方面，SOS介导的应急修复机制可能导致错误修复，从而加速产生耐药突变。

针对SOS反应及recA在细菌耐药性进化中的作用，已有研究主要集中于氟喹诺酮类抗生素，发现单次暴露即可在RecA依赖下显著促进耐药性的产生，表明RecA和SOS反应在该过程中发挥关键作用【3】。然而，β-内酰胺类抗生素与氟喹诺酮在作用机制和SOS诱导能力方面存在显著差异。现有模拟进化研究（如适应性实验室进化，ALE）显示，大肠杆菌通常需要经历多轮β-内酰胺抗生素暴露才能逐渐获得耐药性【4】。

在短期、单次β-内酰胺抗生素暴露下，RecA及其介导的SOS反应是否参与快速耐药性形成，尚缺乏系统研究。对此，悉尼科技大学金大勇团队最新发表的研究工作，首次揭示了一个与经典路径不同的、RecA缺失背景下细菌如何在极短时间内获得多药耐药性的全新机制，为重新理解抗生素压力下的耐药进化提供了重要视角。

近日，悉尼科技大学生物医学材料及仪器研究所金大勇课题组在eLife期刊发表了题为Fast evolution of SOS-independent multi-drug resistance in bacteria的研究论文，揭示了在缺失RecA的情况下，细菌如何在极短时间内快速获得稳定的多药耐药性。

研究发现，在单次氨苄西林暴露后，仅8小时内，RecA缺失的大肠杆菌即可将对β-内酰胺类抗生素的最小抑菌浓度（MIC）提高多达20倍，表现出稳定的耐药表型。这一过程不依赖于传统的SOS反应，而是由两大进化驱动力共同驱动：一是突变供给的增加，二是抗生素选择压力的增强。

机制上，RecA缺失不仅削弱了DNA修复能力，同时显著抑制抗氧化防御基因的表达，导致细胞内ROS的大量积累。ROS进一步促进耐药突变的产生，而抗生素选择压力则加速了稀有耐药突变体的扩增。该研究挑战了“通过抑制RecA/SOS通路可阻止细菌产生耐药性”的传统认知，提出“修复缺陷-氧化失衡”作为细菌耐药演化的新机制，为开发靶向进化驱动力的抗耐药策略提供了全新思路。

为探究SOS反应在细菌对β-内酰胺类抗生素进化过程中的作用，研究人员以大肠杆菌MG1655为模型，构建了recA缺失突变株（ΔrecA）。在为期三周的适应性实验室进化（ALE）实验中，细菌每天接受50 µg/mL氨苄西林处理4.5小时，结果显示，ΔrecA菌株平均在第2天即出现显著耐药，而野生型对照菌株则至少需要两周才能获得相似水平的耐药性。更令人惊讶的是，在仅一次、8小时的氨苄西林处理后，ΔrecA菌株即表现出耐药性。该快速进化现象不仅限于氨苄西林，在青霉素G和羧苄西林等其他β-内酰胺抗生素处理下也观察到了类似结果。进一步分析表明，所获得的耐药性在无药压力下仍可稳定遗传，说明其具备遗传基础。这些结果表明，即使是一次性、短时间的β-内酰胺抗生素暴露，也足以驱动recA缺失菌株产生稳定的耐药进化（图1），这一发现对理解SOS反应缺失背景下的细菌耐药性形成机制具有重要意义。

图1

另一方面，一个关键问题是：ΔrecA菌株的快速耐药性究竟源于整体突变率的提升、抗生素选择压力的增强，还是二者的共同作用？为此，研究者在有无氨苄西林处理条件下，系统分析了ΔrecA菌株的突变频率及其分布特征。在96个独立培养体系中，ΔrecA菌株呈现出高度偏斜的突变分布，表现出典型的“幸运瓶颈”现象（jackpot cultures），即少数培养物中出现了突变的大量富集。尽管如此，非参数统计分析显示，ΔrecA的处理组与未处理组之间的整体突变频率差异并不显著 （图2）。

图2

这一结果提示，快速获得耐药性的机制更可能由抗生素选择作用驱动，而非广泛诱变所致。为了进一步验证这一假设，研究者采用最大似然估计法（MLE）【5】对各组突变率（每个培养体系中的突变数）进行了建模分析。结果发现，ΔrecA处理组的突变率估计值显著上升，且其基础突变率相较于野生型也略有增加。最后，结合Luria–Delbrück经典模型【6】，研究者构建了波动实验（fluctuation test）推理框架。分析表明，ΔrecA菌株在抗生素处理后的突变分布不符合均一诱变的假设，而是支持这样一个模型：β-内酰胺抗生素的选择性压力富集了早期出现的、稀有的耐药突变亚群体。

进一步研究发现，在ΔrecA菌株中确实存在特定的、与耐药性密切相关的突变被抗生素选择性富集。研究人员对获得的耐药性单克隆菌株进行了全基因组测序，结果显示：所有ΔrecA耐药株均携带已知的抗生素耐药相关突变。其中不仅包括与β-内酰胺抗生素密切相关的经典突变位点，如ampC启动子区上调突变及其编码的靶蛋白PBP3对应的ftsI突变，还识别出涉及多重耐药机制的关键突变，如AcrAB-TolC外排系统的acrB位点突变【7】。药物敏感性测试进一步证实了这些突变的功能性：这些ΔrecA耐药克隆不仅对氨苄西林耐药，同时对氯霉素和卡那霉素等其他类别抗生素也表现出明显的MIC升高，表明单次β-内酰胺暴露即可诱导多重耐药表型的出现。

DNA修复能力的缺陷通常与突变积累密切相关，而RecA最为人熟知的功能是调控SOS反应。因此，研究人员首先探究了ΔrecA菌株中快速获得耐药性是否是由于SOS反应缺失所致。为验证这一假设，研究者对多个SOS通路关键基因突变株进行了相同的β-内酰胺抗生素处理，结果发现这些突变株均未表现出类似的快速耐药进化，提示ΔrecA菌株中的耐药性获得并非由SOS通路缺失介导。进一步地，为评估DNA修复功能的变化，研究团队采用单分子定位显微镜（SMLM）对DNA聚合酶I（DNA Pol I）及其在染色体上的定位进行了高分辨率成像分析。结果显示，在药物处理4小时后，ΔrecA菌株中DNA Pol I的表达水平显著下降，且其与染色体的共定位比例也明显低于野生型对照。这些数据表明，RecA在调控DNA修复与突变积累过程中所发挥的作用远超SOS反应本身。ΔrecA菌株中出现的非SOS依赖性DNA修复障碍可能引发基因组不稳定性增加，从而促进耐药突变的快速出现与富集。

为进一步解析本研究中观察到的β-内酰胺类抗生素耐药性快速进化机制，研究人员对氨苄西林处理前后的细菌进行了全转录组测序（total RNA-seq）分析，以探究基因表达的系统性变化。差异表达基因（DEGs）分析显示，药物处理诱导的大多数转录响应与抗生素应激和细菌持留态（persistence）密切相关，包括群体感应、鞭毛组装、生物膜形成和趋化运动等通路。值得关注的是，在ΔrecA菌株中，多个抗氧化相关基因（如 cysJ、cysI、cysH、sodA 和 sufD）的表达仅在药物处理后表现出显著下调。这一抗氧化系统受损可能导致细胞内活性氧（ROS）水平异常升高，进而诱发突变。为验证这一点，研究人员使用荧光探针 DCFDA/H₂DCFDA 结合流式细胞术检测ROS积累情况。结果显示，在氨苄西林处理8小时后，野生型和ΔrecA菌株均表现出ROS水平升高，但ΔrecA菌株处理组的ROS积累显著更高，且与转录组数据中抗氧化基因表达下调高度一致。进一步实验显示，外源添加抗氧化剂谷胱甘肽（GSH）不仅有效阻断了ROS的积累，同时也显著抑制了ΔrecA菌株耐药性的获得（图6），表明ROS在突变产生和耐药进化中发挥关键作用。

此外，转录组分析还揭示了多个DNA修复相关基因的表达变化，特别是碱基切除修复（BER）通路【8】。过量ROS可将dGTP氧化为8-oxo-dGTP，诱发碱基错配和SNP突变。BER通路中的关键酶如 MutH、MutY 和 MutM 负责识别并修复这些突变，但在ΔrecA菌株中，这些基因在药物处理后同样出现显著下调。这种广泛的转录下调提示可能存在转录抑制因子的激活。研究者在ΔrecA菌株中发现了上调表达的典型转录抑制因子H-NS，其已被报道可通过染色质重塑间接抑制多种抗氧化基因的表达，可能在此过程中发挥关键调控作用（图6）。

图6

总体而言，尽管SOS反应及其核心调控因子RecA在细菌抗生素耐药性进化中的作用已被广泛报道，本研究却首次发现：在E. coli ΔrecA菌株中，仅一次β-内酰胺抗生素暴露即可诱导快速且稳定的多重耐药性进化。这一现象无法用传统SOS反应介导的诱变模型解释，而是源于DNA修复功能缺陷与氧化应激增强这两大进化驱动力的协同作用。在RecA缺失背景下，细菌DNA修复能力受损，同时抗氧化防御通路受到抑制，导致ROS积累和基因组不稳定性上升，从而显著提高了产生耐药突变的概率，并在抗生素选择压力下促进耐药克隆的扩张。这一发现揭示了非SOS依赖性耐药进化通路，为理解细菌在抗生素压力下的适应性进化提供了新机制。

正如《eLife》期刊编委所评价：“This study presents a valuable observation of how deletion of a major repair protein in bacteria can facilitate the rise of mutations that confer resistance against a range of different antibiotics.”

悉尼科技大学理学院讲师张乐博士和博士生管运鹏为该论文的共同第一作者，悉尼科技大学工程与信息技术学院高级讲师苏乾和悉尼科技大学生物医学材料及仪器研究所（IBMD）金大勇教授为论文的共同通讯作者。

原文链接：https://elifesciences.org/articles/95058

制版人：十一

参考文献

1.Zhao X, Drlica K. Reactive oxygen species and the bacterial response to lethal stress.CurrOpinMicrobiol.21, 1-6 (2014).

2.Žgur-Bertok D. DNA Damage Repair and Bacterial Pathogens.PLOS Pathogens.9 PLOS Pathogens, e1003711 (2013).

3.Barrett, T.C., Mok, W.W.K., Murawski, A.M. et al. Enhanced antibiotic resistance development from fluoroquinolone persisters after a single exposure to antibiotic.Nat Commun.10, 1177 (2019).

4.Levin-Reisman I, Ronin I, Gefen O, Braniss I, Shoresh N, Balaban NQ. Antibiotic Tolerance Facilitates the Evolution of Resistance.Science.355, 826-830 (2017).

5.Zheng Q. Progress of a half century in the study of the Luria–Delbrück distribution.Mathematical Biosciences, 162, 1-32 (1999).

6.Foster PL. Stress-induced mutagenesis in bacteria.Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 42, 373–397 (2007).

7.El Meouche I, Dunlop MJ.. Heterogeneity in Efflux Pump Expression Predisposes Antibiotic-Resistant Cells to Mutation.Science.362, 686-690 (2018).

8.Foti JJ, Devadoss B, Winkler JA, Collins JJ, Walker GC. Oxidation of the guanine nucleotide pool underlies cell death by bactericidal antibiotics.Science.336(6079): 315-319 (2012).

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