成功解决六十年谜团！新加坡国立大学团队发表Nature 子刊！

革兰氏阴性细菌（Gram‑negative bacteria）如大肠杆菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌等，表面包裹着一层额外的外膜（outer membrane, OM），这个双层脂质结构不仅能抵御多数抗生素，还能阻挡人体自然免疫的溶菌酶，为致病和耐药提供坚实“铠甲”。这层“外膜”为何稳定？它的维护机制为何几十年来成谜？

2025年7月2日，新加坡国立大学团队登上《Nature Communications》，揭示了这一古老谜团，确定了负责维持外膜 (OM) 稳定性的重要蛋白质复合物的主要功能。该研究题为“Primary role of the Tol-Pal complex in bacterial outer membrane lipid homeostasis”。

研究背景

革兰氏阴性菌由外膜 (OM) 定义，OM 有助于包膜完整性和屏障功能。构建此双层膜需要脂多糖、蛋白质和磷脂的正确组装，但这些成分的平衡如何实现尚不清楚。Tol-Pal 复合物是一个长期已知的确保 OM 稳定性的系统，它与维持 OM 脂质稳态有关。然而，由于 Tol-Pal 的隔膜定位及其在分裂过程中的相关作用，其功能分配一直具有挑战性。

在这篇研究，作者通过设计一个失去隔膜富集的嵌合复合物，将Tol-Pal 在 OM 脂质稳态中的作用与其对大肠杆菌细胞分裂的影响分离开来。证明这种位于外周的 Tol-Pal 复合物完全能够维持 OM 中的脂质平衡，从而恢复 OM 的完整性和屏障。这项工作确定了 Tol-Pal 复合物在 OM 脂质稳态中的主要功能，与其在分裂过程中的作用无关。

实验方法

巧妙脱钩，突出脂质功能

为明确 Tol–Pal在膜脂质调控方面的独立角色，研究人员采用以下方法进行了研究：

l基因工程构建：将 Tol–Pal 中段插入 TonB TM 片段，制造一个失去分裂诱导定位但保留脂质功能的嵌合体；

l功能验证：采用核糖体标签与免疫荧光技术验证嵌合体是否仍分布于膜边缘；

l脂质稳态检测：通过放射性同位素标记磷脂（PG/CL）测定外膜中PL 含量，评估遗漏后的积累程度；

l通透性评估：SDS/EDTA敏感实验、OMV（外膜囊泡）释放量检测、RNAse I外漏实验等评估膜完整性；

l对比评价：将具有 TonB-TolA 嵌合体菌株与 Δtol-pal（完整缺失）和野生型进行多重表型比较。

不仅如此，作者综合上文细菌膜系统研究文献，如Tol–Pal调控外膜 LPS/PL 结构平衡的早期理论以及 OM 稳固多机制协同关系，构建了一整套验证系统。

实验结果

脱钩后仍能稳膜，证真脂质核心功能

研究人员首先通过构建一个TonBTM-TolA 嵌合蛋白，揭示 TolA 在维持细菌外膜完整性方面的功能可以脱离细胞分裂定位而独立实现。

研究者将 TolA 的膜穿越区替换为 TonB 的跨膜螺旋，使其能够与 ExbBD 复合物而非 TolQR 互作。由于 ExbBD-TonB 复合体不会定位到分裂位点，这一设计使嵌合体失去分裂相关定位功能，但仍可能保留 TolA 在膜脂稳定中的作用。在大肠杆菌 ∆tolQRA 缺失菌株中表达 TonBTM-TolA 后，菌株对 SDS/EDTA 和万古霉素的耐受性显著增强，表明其外膜屏障功能完全恢复。相比之下，仅表达野生型 TolA 的恢复效果较差。这些结果明确指出：TolA 的膜稳态作用可独立于其分裂定位功能，并依赖其与 ExbBD 的有效互作，揭示 Tol-Pal 复合体在细菌外膜脂质稳态中的核心作用。

研究发现，TonBTM-TolA 嵌合蛋白无法定位至细胞分裂位点，也不能促进 Pal 在中隔富集，因此无法修复 Tol-Pal 缺失导致的分裂缺陷。荧光显微显示，sfGFP-TonBTM-TolA 在细胞膜周围均匀分布，而非聚集于中隔。Pal-mCherry在 ∆tolQR 背景中未能恢复中隔定位，进一步证实 TolA的分裂功能依赖其定位特性。尽管如此，TonBTM-TolA 能完全恢复外膜屏障功能，并纠正 tol-pal 缺失导致的细胞形态异常，提示该嵌合体在周边定位即可维持外膜脂稳态。

此外，研究表明，虽然 ExbBD-TonBTM-TolA 嵌合体失去中隔定位能力，但其仍能恢复 Tol-Pal 缺失菌株的外膜脂稳态功能。该嵌合体显著减少外膜囊泡（OMVs）释放量约79%，并有效降低异常升高的磷脂/脂多糖（PL:LPS）比例与 hepta-acylated LPS 水平，恢复至接近野生型。说明 Tol-Pal 的主要功能是维持外膜脂稳态与结构稳定，而非依赖中隔定位。该发现有助于明确 Tol-Pal 的功能核心，也为今后操控外膜稳态提供了潜在策略。

总结

本研究明确Tol-Pal维持外膜脂稳态的功能可独立于其细胞分裂作用，揭示其主要生理职责在于调控外膜脂质组成与稳定性。未来应聚焦于Tol-Pal是否通过驱动磷脂回收实现脂稳态，并探索其在细胞分裂中调控膜曲率与内陷的潜在机制。

专家表明，这一突破标志着我们对细菌外膜组装和脂质运输的整体理解取得了重要的概念进步，也证明了我们为阐明活细胞基本机制所做的持续努力。

https://www.nature.com/articles/s41467-025-57630-y#Sec2

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