动物行为与光电专题（61）丨小鼠结肠炎模型钙成像相关总结

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神经元胞质钙离子浓度变化是其兴奋性和反应性的重要指标。细胞内钙瞬变反映神经元对内外刺激产生的兴奋性反应的大小。GCaMP在神经科学中的应用，使得实时动态可视地监测特异或非特异神经元群的活动成为现实。

采用24只成年Pirt-GCaMP6s小鼠，体质量25~30g，8~12周龄，雌雄各半，进行DRG神经元的钙成像研究。小鼠饲养环境按照标准的12h光照/12h黑暗循环，自由摄食、饮水。所有行为学实验均在9:00至13:00的光照期内进行，检测人员对动物分组不知情。小鼠于行为学实验前3d和1d在行为学实验室适应两次，并在每次实验前适应30min。

TNBS诱导结肠炎模型

随机选取4只BALB/c、8只C57BL/6J和12只Pirt-GCaMP6s小鼠作为结肠炎组，其余小鼠作为对照组。结肠炎组小鼠用2%的异氟烷气体麻醉，凡士林润滑肛门周围并保护皮肤不与灌肠药物接触。5%TNBS在50%的乙醇溶液中稀释至2.5%。以每只小鼠100µL的剂量通过注射器连接聚乙烯导管经肛门直肠给药，给药深度15~20mm。为避免药物外溢，仰卧位45°角抬高鼠尾，1min后放回饲养笼，连续7d。对照组采用等剂量0.9%氯化钠溶液灌肠。以小鼠粪便性状发生改变，粪便呈稀糊状且为血便为造模成功标准。

观察指标与检验方法

皮肤EB外渗实验：造模7d后，对BALB/c小鼠尾静脉注射EB染料（1%）100µL。EB注射后30min，经心脏灌流0.1mol/L的PBS。剃毛后观察皮肤的蓝色渗出位置并拍照，使用Image J软件测量其皮肤上蓝色渗出面积，量化神经源性炎性反应的面积。

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小鼠行为学实验：

造模7d后，检测C57BL/6J小鼠对下背部、双侧足底机械痛刺激的行为反应，计算回避或缩足次数，评估小鼠对机械刺激的敏感性。剃除C57BL/6J小鼠下背部的毛，露出皮肤，置于单独的塑料箱中，并在实验前适应30min。然后实验人员用Von Frey细丝垂直刺激测试区域皮肤至纤维丝弯曲，下背部的刺激量为0.04g，后爪为0.4g，每次接触1s，重复10次为1组。在下背部测试中，如果小鼠（1）突然前行或转身（2）跳跃（3）立即舔、抓或擦拭刺激部位，则计为阳性回避反应。在后爪部测试中，若小鼠快速垂直或水平移动后爪远离刺激，则计为阳性缩足反应。如果诱发了阳性反应，则需在小鼠复位后再施加下一个刺激。阳性反应以回避或缩足次数表示，每只小鼠重复测试3组，每组间隔5min，计算平均值。

DRG神经元反应性：造模7d后，每组取6只Pirt-GCaMP6s小鼠给予60 mm Hg（1mmHg≈0.133kPa）压力的直结肠扩张（colorectal disten⁃tion, CRD）刺激和下背部皮肤毛刷刺激，观察L6DRG神经元钙活动的变化；另每组取6只给予后爪皮肤机械（毛刷、200g钳夹）刺激，观察L4DRG神经元的变化。给予上述刺激之前，Pirt-GCaMP6s小鼠用2%的异氟烷麻醉，气管插管。行部分椎板去除术暴露右侧L6或L4DRG，剥离鞘膜，清理出血。小鼠俯卧位固定在定制的显微镜台上，脊髓夹固定所记录节段DRG上或下一节的锥体上关节突，固定台可以上下及轴向调节，使小鼠被检测的DRG充分暴露在物镜下，成像全过程避免任何位移。实验全程通过气管插管进行呼吸麻醉监控，鼠尾套管式红外传感器无创监测心率和血氧饱和度。将小鼠置于10×/0.3的长工作距离的共聚焦荧光显微镜空气物镜下成像。以14s/帧速度1024×1024像素分辨率对完整的L6或L4DRG进行z轴延时叠加，并根据DRG大小和角度调整。成像过程全程用反馈式保温和加热垫使小鼠体温保持在36.0~37.0℃。激光波长为488nm，激光强度为5%，扫描速度为400~600Hz。神经元被激活可引起GCaMP与细胞内Ca2+结合，发出绿色荧光。神经元激活引起荧光强度变化以刺激诱发的最大亮度与基础亮度的比值（Ft/F0）表示。神经元激活的定义为荧光强度的增加≥基线30%。通过比较CRD刺激、体表毛刷刺激或压力刺激所激活的神经元数量占总数的百分比和荧光强度的变化来判断躯体神经元敏化。小型、中型和大型神经元胞体直径分别为<20μm、20~30μm、>30μm。

通过Pirt-GCaMP6s小鼠在体观察DRG中神经元群钙离子荧光的瞬时变化，量化内脏痛诱发的神经元活动变化。分别给予对照组和结肠炎组小鼠CRD 60 mm Hg刺激，记录刺激前后L6DRG神经元的变化。

结肠炎小鼠体表EB渗出点和机械痛阈值的变化

TNBS模型小鼠对下背部和后爪的机械刺激表现出更容易诱发回避或缩足行为，说明这些部位皮肤存在感觉过敏。而下背部皮肤和后爪分别由L6和L4DRG支配。

参考文献：

• Investigation of Pain Mechanisms by Calcium Imaging Approaches[J]. Michael Anderson;Qin Zheng;Xinzhong Dong.Neuroscience Bulletin,2018(01)

• 高昕妍,张楠,刘坤,等.结肠炎模型小鼠内脏痛及穴位敏化的外周神经机制探讨[J].针刺研究,2023,48(12):1183-1192.