Cell丨碱基编辑技术助力免疫缺陷变异精准诊疗

撰文 | 染色体

新一代测序（NGS）技术显著推动了先天性免疫缺陷病（IEI）等遗传性疾病的诊断【1】。然而，大多数识别出的变异为意义不明变异（VUS）【2】，由于缺乏功能验证或临床数据，致病性难以判断。目前常规功能解析方法效率低，往往造成诊疗延误，影响患者预后。

近日，美国哥伦比亚大学的 Benjamin Izar 与欧文医学中心的 Joshua D. Milner 共同在 Cell 期刊发表题为 Scalable generation and functional classification of genetic variants in inborn errors of immunity to accelerate clinical diagnosis and treatment （先天性免疫缺陷病中遗传变异的高通量生成与功能分类加速临床诊断与治疗）的文章。 研究利用高通量碱基编辑系统在人体T细胞中筛查PIK3CD/PIK3R1变异，系统解析PI3Kδ激活综合征（APDS）相关突变的功能，评估其对PI3Kδ抑制剂Leniolisib（Len）及其联合治疗的药物反应。研究结果有助于明确VUS在IEI中的临床意义，显著提升疾病的诊断与治疗效率。

APDS是一种由PIK3CD或PIK3R1基因突变引起的IEI，导致T细胞内PI3K/AKT信号过度激活，临床表现包括免疫功能低下、自身免疫、过敏和反复病毒感染等【3】。对该病的流行病学和临床谱认识仍有限，诊断高度依赖于已知致病变异和功能验证。部分PIK3R1变异还与发育缺陷（如SHORT综合征）相关。虽然PI3Kδ抑制剂Leniolisib已获批用于治疗APDS，但尚缺乏系统性的功能变异图谱和临床数据整合，限制了广泛精准诊断与靶向治疗的实施【4】。

APDS致病变异的精准高通量功能筛查

首先，研究人员采用CRISPR-腺嘌呤碱基编辑技术，在人T细胞中构建覆盖PIK3CD和PIK3R1全部编码区及部分非编码区的sgRNA文库。通过流式细胞术检测AKT与S6蛋白磷酸化水平，系统评估各类突变对PI3Kδ信号通路的影响，实现GOF（获得功能）与LOF（丧失功能）突变的高通量功能筛查。筛查不仅准确识别出所有已知致病变异，同时对临床数据库中的良性变异未见显著富集，验证了方法的灵敏性与特异性。相比传统的细胞增殖指标，信号通路指标如pAKT/pS6更能灵敏捕捉突变效应。研究还将变异结果映射至PI3Kδ蛋白三维结构，发现功能突变广泛分布于多个结构域，尤其是亚单位结合界面，其中部分突变在空间上靠近，提示其可能协同调控蛋白功能。与AlphaFold和AlphaMissense等计算工具对比发现，尽管部分预测与实验证据一致，但许多功能显著突变未被预测工具识别，强调功能实证的重要性。

新型变异的功能验证与结构解读

研究人员从筛查中选取26个代表性sgRNA，涵盖PIK3CD和PIK3R1多个功能结构域的新增变异和VUS，通过阵列化碱基编辑在人T细胞中进行逐一验证。功能检测结果显示，已知GOF突变显著增强AKT/S6磷酸化，LOF突变则抑制该信号，VUS与新变异的功能也与筛查预测高度一致，进一步验证筛查的准确性。更重要的是，突变在筛查中的效应强度（LFC）与阵列实验中的pAKT水平高度相关，说明筛查数据还可初步反映功能强度。研究还将验证后的变异定位至PI3Kδ三维结构，进一步揭示突变分布与功能影响的空间特征。针对同一sgRNA可能导致多种氨基酸改变、造成功能解析困难的问题，研究引入编辑窗口更窄的下一代碱基编辑器ABE9，结合精确的sgRNA设计策略，成功实现了多个相邻变异的功能拆解，提升了突变解析的分辨率与准确度。

变异对Leniolisib的响应及临床意义

研究进一步评估20个筛选得到的PIK3CD/PIK3R1 GOF变异对Leniolisib的敏感性。几乎所有变异在Leniolisib处理下均表现出明显的pAKT/pS6下降，显示良好的药物响应。然而，PIK3R1 inter-SH2（iSH2）结构域内的多个GOF变异（如p.K567G、p.L570P、p.L573P及剪接位点突变）仅部分响应Len，提示存在药物耐受现象。体外T细胞功能检测显示，携带GOF变异的细胞普遍处于激活与耗竭状态（PD1、CTLA4、TOX上调，TCF1下调），Len可有效逆转这些异常表型但不影响细胞增殖。值得注意的是，iSH2变异对Len逆转耗竭表型的反应较差，提示其临床疗效受限。随后研究对两位APDS患者样本进行了深入分析，发现其T细胞信号活性及耗竭表型与体外模型一致，并在Len治疗下显著改善，但PIK3R1突变携带者仍表现出部分耐药。为此，研究团队设计了Len与mTORC1抑制剂（雷帕霉素或依维莫司）的联合用药策略，在多个变异模型和患者样本中验证了组合疗法可进一步抑制异常信号，改善T细胞功能，提示其临床转化潜力。此外，研究在人群数据库中筛查发现PIK3CD/PIK3R1 GOF变异携带者频率约为1/5000，远高于APDS既往估计，且这些携带者常伴免疫功能障碍及相关临床表型，暗示APDS患病率可能被低估。

综上所述，该研究 利用CRISPR腺嘌呤碱基编辑在人T细胞中系统解析PIK3CD/PIK3R1变异对PI3Kδ信号通路的影响，精确分类出百余个VUS与新致病突变，并发现其在人群中并不罕见。研究还揭示了Leniolisib治疗反应的结构基础与耐药机制，并提出可行的联合用药策略，推动IEI和相关免疫疾病的精准诊疗进程。

https://doi.org/10.1016/j.cell.2025.05.037

制版人： 十一

参考文献

1. Al-Mousa, H., Abouelhoda, M., Monies, D.M., Al-Tassan, N., Al-Ghonaium, A., Al-Saud, B., Al-Dhekri, H., Arnaout, R., Al-Muhsen, S., Ades, N., et al. (2016). Unbiased targeted next-generation sequencing molecular approach for primary immunodeficiency diseases. J. Allergy Clin. Immunol. 137, 1780-1787. https://doi.org/10.1016/j.jaci.2015.12.1310.

2. Landrum, M.J., Lee, J.M., Riley, G.R., Jang, W., Rubinstein, W.S., Church, D.M., and Maglott, D.R. (2014). ClinVar: public archive of relationships among sequence variation and human phenotype. Nucleic Acids Res. 42, D980-D985. https://doi.org/10.1093/nar/gkt1113.

3. Preite, S., Cannons, J.L., Radtke, A.J., Vujkovic-Cvijin, I., Gomez-Rodriguez, J., Volpi, S., Huang, B., Cheng, J., Collins, N., Reilley, J., et al. (2018). Hyperactivated PI3Kδ promotes self and commensal reactivity at the expense of optimal humoral immunity. Nat. Immunol. 19, 986-1000. https://doi.org/10.1038/s41590-018-0182-3.

4. Rao, V.K., Kulm, E., Grossman, J., Buchbinder, D., Chong, H., Bradt, J., Webster, S., Sediv á , A., Dalm, V.A., and Uzel, G. (2024). Long-term treatment with selective PI3Kδ inhibitor leniolisib in adults with activated PI3Kδ syndrome. Blood Adv. 8, 3092-3108. https://doi.org/10.1182/bloodadvances.2023011000.

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