Nat Genet | 利用类器官绘制志贺菌定植肠上皮所需基因的图谱

撰文 |章台柳

福氏 志贺菌（ Shigella flexneri ）是一种人类和灵长类限制性病原体，可引发细菌性痢疾。与其他适应人体的微生物一样，由于缺乏能模拟人体生理学的动物模型，针对志贺菌发病机制的体内分子研究颇具挑战性。先前的研究已确定，志贺菌的毒力因子依赖三型分泌系统（T3SS）及其相关效应蛋白，促进其在非吞噬细胞中的入侵、胞质定植和扩散。这些毒力因子大多由一个大毒力质粒（pINV）编码，其表达受环境刺激严格调控【1】。虽然肿瘤来源的细胞系已被用于分析志贺菌T3SS效应蛋白的作用，以及筛选与侵袭行为相关的染色体位点，但与天然上皮细胞相比，这些细胞系的形态、代谢、信号传导和细胞死亡途径均发生了改变。动物模型的局限性也阻碍了体内高通量正向遗传学筛选的应用。因此，志贺菌基因组的大部分基因对生理结构完整的肠道上皮定植的贡献仍未明确。

近日 ，来自 瑞典乌普萨拉大学的 Mikael E. Sellin 、 Maria Letizia Di Martino 和德国亥姆霍兹 感染研究中心 的 Lars Barquist 、 Laura Jenniches 团队合作 在 Nature Genetics 杂志上发表文章 A scalable gut epithelial organoid model reveals the genome-wide colonization landscape of a human-adapted pathogen ， 通过将肠类器官和结肠类器官的大规模志贺菌感染实验、转座子定向插入测序和贝叶斯统计建模相结合，建立了志贺菌感染人类肠道上皮所需要基因的全基因组综合图谱。该研究揭示了志贺菌毒力效应蛋白对于不同几何结构和肠道节段上皮细胞定植的必要性，确定了该过程中涉及的100多个染色体基因，并揭示了一种转录后机制，即tRNA修饰酶和不同的密码子使用对细菌毒力程序进行全局调控。

志贺菌在上皮细胞迁移后，优先从基底外侧感染肠道上皮细胞（IECs）。研究人员构建具有基底向外极性的肠类器官悬浮培养物。使用志贺菌感染3小时，IECs中出现志贺菌感染灶。感染后3 -9 小时之间，感染灶大小增加，细胞间传播很明显。为了使用转座子定向插入测序（TraDIS）绘制志贺菌在肠类器官定植所需的基因集，研究人员对以下关键参数进行优化：（1）细胞内细菌群体的大小；（2）感染瓶颈的影响；（3）感染后细菌生长富集步骤的作用。将全基因组规模筛选应用于感染检测的一个关键挑战是群体瓶颈的存在。在感染模型中，当屏障防御、营养限制或定植位点竞争等因素导致群体规模暂时减小，而与单个突变体的适应性无关时，就会出现瓶颈。这会导致没有真正毒力表型的突变体随机丢失，从而扭曲结果。经过量化检测，在无选择作用的假设下，瓶颈大小约为2 000 个细菌。志 贺菌在37°C时 会表达其三型分泌系统（T3SS），这会导致生长抑制，因此富集温度可能会因对生长的影响而潜在地影响输入和输出文库的整体组成。结果显示，在 30°C进行细菌输 入和输出富集，对于避免志贺菌感染类器官或其他感染模型中TraDIS实验的有偏结果似乎至关重要。

为确定志贺菌在人类上皮细胞定植所需的因素，研究人员将肠类器官感染检测方法扩展为使用Tn5突变体文库的全基因组筛选。根据前期实验优化了感染检测方法，以平衡成本、实验通量和分析难度。考虑到约2000个细菌的感染瓶颈，以及感染后可回收1000-2000个独特的插入位点，研究人员预计含有2000-3000个独特Tn5突变体的子文库可将随机损失限制在约50%。因此，为实现至少80%的覆盖度，对43个平行实验中的每一个使用约40个子文库，每个子文库感染800个肠类器官。在感染后6小时，每个感染样本回收约400,000-200,000个细胞内细菌。然后在 30°C下 培养14小时，以尽量减少选择偏差。如预期的那样，在输入文库中仅观察到独特的插入位点，但输入和输出文库的组合提供了对染色体和pINV（侵袭性质粒）的完整覆盖，读长分布均匀地分布在43个样本中。该方法总共筛选了约127,000个克隆，并鉴定出8500个具有定植缺陷（by TraDIS）的独特Tn5突变体，涵盖了约86%的注释基因（至少有一个插入位点）。为了进行统计分析，研究人员还开发了针对实验设计量身定做的贝叶斯模型、为处理随机损失将负二项分布和零膨胀泊松分布结合的ZINB分布等分析框架。鉴定出105个染色体基因促进志贺菌在肠类器官中的定植，其中超过7 0% 的基因并未报道与志贺菌上皮定植相关。新发现的重要功能基因包括：应激调节因子RpoS、抗适配体淡白IraM、多聚核苷酸转移酶PNPase、多种转运蛋白（ NikB 、 FruB 、 NagE 、 ArgO 、 YfeH 、 BrnQ 、 YhjX 、 TsgA 、 CusA ）、β-酮脂酰ACP合酶II FabF 、tRNA修饰酶（MnmE/G）和硫代谢相关基因（ yftE 等4种）。同时鉴定出61个基因会降低志贺菌定植能力，主要包括：LPS和O抗原合成基因簇（ waaO 、 rfbD 等9个基因）。在侵袭性质粒（pINV）上，鉴定出3 8 个对志贺菌定植类器官必需或有益的基因，主要包括转录调节基因 virF 和 virB 、III型分泌系统（T3SS）结构基因（含mxiD等）以及肌动蛋白介导胞内传播的关键基因icsA。研究成功地将TraDIS与高通量肠类器官感染相结合，生成了首个志贺菌在未转化人类上皮细胞定植所需基因的全基因组图谱。

为了验证T 3 SS相关成分对志贺菌定植的影响，研究人员首先准备条形码标记的菌群：六种菌株等量混合（1:1:1:1:1:1）的接种物，包括两个野生型（tagA，tagB）、两 个 ΔmxiD （tagC，tagD ，作为对照菌株，缺乏T3SS结构成分，不具有侵袭性 ）以及针对特定效应蛋白的两个突变体菌株（tagE，tagF）。然后，感染具有基底向外极性（BO）的肠类器官以及顶端向外极性（AO）的肠类器官、BO 结肠类器官和 AO 结肠类器官。结果显示，在BO肠类器官中， ipgD 和 icsB 基因的缺失导致定植能力出现轻微但显著的下降。而在AO肠类器官中， ipgD 缺失未引起显著的定植减少，但icsB缺失仍表现出轻微影响。相比之下， ipgB1 的缺失使定植能力明显减弱（BO中约降低2倍，AO中约4倍），而 ipgB1 和 ipgB2 双缺失 （ ΔipgB1/B2 ）的 影响更为显著（BO中约4倍，AO中超过10倍）。 ipaA 缺失在BO肠类器官中影响较小（突变株侵袭力比野生型低约30%），但在AO肠类器官中导致约5倍的定植减弱。此外， VirA 缺失在BO和AO肠类器官中均造成约2倍的定植减弱。随后使用相同菌群感染BO和AO结肠类器官进行类似的探究。综合来说，结果揭示了志贺菌毒力效应蛋白对于不同几何结构和肠道节段上皮细胞定植的必要性。

最后，研究人员对志贺菌染色体上的基因进行验证。有趣的是，TraDIS结果显示tRNA修饰酶MnmE和MnmG能促进志贺菌在肠类器官中的定植。MnmEG复合物可特异性修饰tRNA反密码子摆动尿苷（U34）的第5位，包括tRNA Arg -mnm 5 UCU、tRNA Gly -mnm 5 UCC、tRNA Leu -cmnm 5 UmAA、tRNA Gln -cmnm 5 s 2 UUG、tRNA Glu -mnm 5 s 2 UUC和tRNA Lys -mnm 5 s 2 UUU。研究人员推测 MnmE和MnmG可能通过调控翻译过程发挥作用，因此进行了蛋白质组学分析。在ΔmnmE突变株中鉴定的2,153种蛋白质里，与野生型相比，154种显著下调，71种显著上调。ΔmnmG突变株的蛋白质组变化几乎完全相同（158种下调，72种上调） 。在显著下调的蛋白质中，有25种是由pINV质粒编码的毒力蛋白，包括VirB转录调控因子、III型分泌系统（T3SS）结构组分（如IpaB、IpaC、MxiA、MxiC、MxiH、MxiN、SpaM、Spa33和Spa47）、早期效应蛋白（如IpaA和IpgB2）以及晚期效应蛋白（如OspC2、OspC3、OspF和PhoN2）。经过验证发现，志贺菌毒力基因具有特异性的密码子选择性，与MnmE/G tRNA修饰酶进行协同作用，从而实现全局性毒力控制。

总的来说，这项研究开发了志贺菌批量感染肠类器官的试验方法，以及对筛选结果优化分析的统计学方法，建立了志贺菌定植非转化上皮所需基因的全基因组深度图谱。

https://www.nature.com/articles/s41588-025-02218-x

制版人： 十一

参考文献

1. Sansonetti, P. J., Kopecko, D. J. & Formal, S. B. Involvement of a plasmid in the invasive ability of Shigella flexneri.Infect. Immun.35, 852–860 (1982).

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