小分子量蛋白（11KD）WB 实验艰辛历程及经验总结

个人工作多年以后再回来读博的，所以实验技术什么的从头学起，这其中 WB 走的弯路最多，现在就和大家聊聊我个人的历程，并交流一下自己的经验。这个经验是我跑一个 11KD 分子量分泌性蛋白得出的，肯定不会适用于所有情况，但是受困于小分子量蛋白 WB 的朋友还是很多，所以聊胜于无，在此分享一下。

我搞的蛋白质是一个 11KD 的分泌性蛋白，并且是我实验设计中一个重要的指标，最初学习 WB 技术，受困于二抗不合格一直连内参都做不出来......后面改换抗体之后，才相对顺利一点，其他指标也相继出来了。所以，抗体真的很重要。

但是在做 WB 实验的 7、8 个月过程中，核心的一个蛋白一直处于混沌状态，可能跑 30 次能现身一次，现身之后又没影好几个月，就这样捉摸不定，搞得我很烦，但又无可奈何。询问了实验室的同学们，说法各一：

1、有人说小分子量蛋白就是难跑，为什么难大家也说不清楚。

2、有的说分泌性蛋白本身胞内含量少，不好跑，需要加大上样量，似乎也是实话。

3、还有的说小分子量蛋白容易降解，你的蛋白质降解了吧，我姑且信了。但是 95% 的时候我跑出的条带都是大白板，纵然我通过 PCR、细胞的免疫荧光都能够发现这个蛋白，但是就是 WB 做不出来。

4、也有朋友告诉我说分泌型蛋白你还是做 ELISA 吧，可是一来这个蛋白的 ELISA 试剂盒好贵的，二来我就是想做 WB。所以就开始了上下求索之路。95% 的时间跑出来的条带是这样的……

（图：实验条带）

这一求索就是几个月的时间。期间一直觉得电泳没什么技术含量，电转的过程才是重点，于是纠结于电转条件，也纠结过电转液的配置等。再次翻阅丁香园论坛里面大神的回帖，其中一个大神提到：小分子量蛋白容易在电泳过程中弥散，电泳在压缩胶里多压一会，在分离胶里面跑一半就好了。对这个话百思不得其解，于是开始查询一些实验技术方面的文献，其中有几篇文献对我很有启发，有些技术原理方面的内容如下：

在含 SDS 缓冲液的样品中，小分子多肽的浓缩是较困难的，因为小分子多肽与 SDS 形成的复合体具有与 SDS 本身类似的电荷和大小，所以偏离了相对迁移率和分子质量对数的相互关系，因此浓缩对于小分子多肽的 SDS-PAGE 来说就成了一个突出问题。

于是回去翻了翻自己曾经偶然跑出来的条带的模样，给我的感觉就是压缩的不好，然后还有弥散的现象（就是那种蛋白晕开的模样，例如这条带下面的波浪边缘，当然也可能是胶不均匀的原因吧，反正我当时就觉得是弥散的现象）。

（图：实验条带）

然后我就突然有种恍然大悟的感觉，也许说的不对，但是我个人的感觉是：

一般较大的分子量的蛋白（如 20-70KD）与上样缓冲液中的 SDS 结合后，因为本身蛋白分子大，SDS 附着在上面之后，还是和胶里面的 SDS 成分有较大差异的，那么在一定电流方向的作用下，就能够顺着电流方向向下电泳；而小分子蛋白被 SDS 包裹结合形成复合物后，因为蛋白分子小，包裹上 SDS 后就和胶里面本身的 SDS 差别没那么大了，那么此时就算有电流作用，它也不会那么听话的顺流而下，毕竟和周遭的胶里面的 SDS 区别不大，在电泳向下走的过程中，可能向其他方向混乱的运动，走着走着就晕染开了，就像墨点到宣纸上一样。

所以回到前面大神说的话，让多压一会，那么就是为了让小分子蛋白尽量聚集；少电泳一会，就是稍微跑开 marker 之后，能够分开小分子蛋白和内参即可，加入跑多了，例如溴酚蓝跑到下沿 1 cm 以上的位置，那时候可能小分子蛋白就又晕染开消失在胶里面了，这样的话一抗也就不能识别那么弥散的蛋白了。（专业人士原谅我粗浅的认识哈，也许不对，但是我理解的就是这样，我就是打个比方让其他的科研小白能理解。）

然后在论坛里面还看到一个建议就是用 0.2% 的戊二醛固定转膜完成后的条带 45 分钟，再进行后续封闭漂洗等步骤，为的就是防止小分子蛋白在后续操作中洗脱了。于是乎说干就干，开始了我再次改进的实验历程，说来简单，实际上从 25 号到 1 号，一共 8 天时间，我大概做了 12 次 WB，终于能够重复出来结果了。要点如下：

1、电转液中一定不要加 SDS。对于大分子量蛋白加入 SDS 是为了增加转膜效率，道理上是增加了蛋白表面电荷。而对于小分子量蛋白，SDS 千万不能加，否则会封闭小分子蛋白的抗原位点。（我忘记从哪里看到的了，文献不能在这里给出，大家勿吐槽我哈。）

2、从最开始纠结于电转过程，使劲摸索电转条件，现在发现电泳过程同样很重要啊。电转的时候其实只要预染 marker 转到膜上了，那么你相应分子量的目的蛋白也就转过去了，所以这就是你摸索条件的指示带。

3、电泳过程中有推荐 TRICINE-SDS-PAGE 胶来进行电泳，会更有利于小分子量蛋白的分离，研读了一些文献，这个效果应该还是很肯定的，但是鄙人没有做过这种电泳，所以给不了什么经验，我最终还是用普通 SDS-PAGE 胶做出来的，不过鉴于我的蛋白分子量是 11KD，那么假如你是几 KD 甚至更小分子量的多肽，那么还是建议你用 TRICINE-SDS-PAGE 胶来电泳吧。

4、在我用 SDS-PAGE 胶进行电泳过程中，一直以来都是按照说明书配制压缩胶和分离胶的，并且在说明书中，以配置 2 块胶为例，分离胶说明书中是让配置 10 ml，压缩胶是 3 ml。我一直以为是对应关系，在这次大悟之后我发现分离和压缩完全不是一对一对应关系，人家只是给了你配置这么多体积胶的配方而已，虽然在一个纵列上，但是绝不是对应关系。（我确实才觉悟，高手轻鄙视哈。）

5、接上一条经验，所以我在配胶过程中，下层分离胶配制了 10 ml，但是实际上每块玻板里面只加了大概 3.5 ml 吧，也就是整个玻板高度的 60-70% 的样子。然后压缩胶配了 6 ml，玻板填满插梳子，等凝固。这里我就是想让我的小分子蛋白尽量在浓缩胶里面多浓缩、压扁，这样后续再分离胶里面，即使弥散一些，也总还有剩下的。

6、电泳开始，在浓缩胶层里面跑的时候，我是 60-70V 电压，跑了大概快一个小时，反正就是溴酚蓝都集中在上下层胶的那个界面的位置，并且在界面那里好半天都不动了，那么这个过程我理解就是小分子量蛋白虽然表面电荷和胶里面的 SDS 相当，但是终究还是会沿着电流方向定向移动的，所以就多压一会吧。然后开始调整电压为 110-120V 在分离胶里面跑，我是跑到分离胶一半的位置就停止电泳了，这时候 marker 已经分开一些了。

7、接上一条，marker 分开了一些，但是实话说分的并不好，你如果想同时测好几个蛋白指标是很困难的，不好切胶，也不好敷条带，所以我的建议，小分子蛋白就单独出来跑吧。

8、电泳完成后，开始电转，电转过程我试过 90V 恒压 60 分钟，也试过 250ma 恒流 15 分钟，对于我的蛋白都能得到满意结果。

9、转膜后条带是否必须戊二醛固定？经过我的尝试，对于我的 11KD 蛋白来说固定不固定没有影响，那么即使固定了，戊二醛也不会影响后续的抗原抗体反应。所以各位同学们固定不固定随意吧，假如你的蛋白分子量很小，也许 5KD 以下？那么固定一下也未尝不可。

10、抗原抗体反应很灵敏，我的抗体在免疫荧光上面已经验证过的，所以敷抗体的过程没什么说的。不过抗体稀释比例的话，我是习惯提高浓度的，说明书 1：1000，我就 1：500。这个没有依据，纯癖好，也是师兄们教的。

11、显影这一步我觉得也有可说的。我试过多次，发现我的这个蛋白第一遍滴加显影液后条带不会很清晰，然后你可以把条带拿出来就放一边让它反应一会，然后再放回机器里面，重新滴加显影液显影，效果就会好不少。还有显影时间，结合我的示例，机器给出的自动曝光时间是 30 几秒，我就直接加 1 分钟改为 1 分 30 几秒，然后就得到了下面的条带。

第一遍显影条带，可以看到模糊有东西，但是不清楚，于是我拿出来放一边反应一下。

（图：实验条带）

反应几分钟后，我再把条带放进机器，时间上直接增加 1 分钟，再滴加新的显影液，是不是好了很多。

（图：实验条带）

到这里我就总结完了我的经验和教训。当然这 7、8 个月的摸索，还有很多想说的，但是限于篇幅和叙事能力有限，就大致总结了几条，有些啰嗦，见谅。希望对还被小分子量蛋白 WB 折磨的朋友们有帮助。

来源：丁香园社区

站友：windkiller1984

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