动物模型构建与评估︱学习认知动物模型

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学习和记忆都属于认知行为，它是人和动物十分特殊的脑功能。学习是指人或动物通过实践获得新信息从而改变之后的行为模式，而对过去已经感知的事物和思考过的问题的印象仍然留存在脑中，在某种条件下能够重现的心理过程叫做记忆。学习和记忆的过程是一个机制复杂的过程，为了能够有针对性地对学习和记忆机制进行研究，现阶段，有着各种针对学习记忆行为进行研究的测试实验方法。绝大多数的学习记忆实验要求训练动物对阳性刺激（如电刺激）或避免负性强化（如禁食、禁水）做出反应，所以学习记忆实验的激发因素在整个实验中起着非常重要的作用。

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跳台法

非联合型学习是一种在刺激与反应之间没有明确联系的简单学习形式，指对单一刺激做出的行为反应的改变。记忆功能测定给药后第6天和第7天，分别于当天给药后1h通过跳台法观察动物学习及记忆能力。先将小鼠放入反射箱中适应环境3min，然后立即通以25V连续电刺激5min，小鼠遭电击后跳下跳台，以小鼠双足同时接触铜栅为触电，视为错误反应。如此训练5min并记录5min内错误次数，24h重测，观察其记忆情况。测验时，先将小鼠放于跳台上，记录小鼠第1次跳下潜伏期(即将小鼠放到台上开始计时，到第1次双足触电时间)和5min内错误总数。

迷宫类实验（Morris水迷宫、Ｔ迷宫和八臂放射状迷宫等）可以检测空间参考记忆，实验中，大鼠和小鼠经过多次训练，学会在各种类型的迷宫中寻找固定位置的隐蔽平台/出口/食物，从而形成稳定的空间位置认知，是一种以异我为参照点的参考认知，隐蔽平台/出口/食物的位置与动物自身所处的位置和状态无关。这种空间参考记忆的储存机制主要涉及边缘系统（如海马）以及大脑皮层有关脑区。Ｔ迷宫、Ｙ迷宫等行为实验评价的“工作记忆”，一般指“短时记忆”，是对“正在经历”的信息进行短暂储存和加工以指导下一步行动计划。

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Morris水迷宫实验

Morris水迷宫是评价动物空间学习记忆能力的经典行为学实验，它能有效地分离动物空间辨认与其它能力。在对小鼠进行持续90d的实验后，通过Morris水迷宫对其学习与记忆能力进行测定。实验内容共分为2部分：（1）定位航行实验，将小鼠投入水池后马上进行计时，当小鼠四肢爬上平台后，并且四肢在平台上的停留时间＞5s时，即为小鼠的一个逃避潜伏期，记录该时间。本次实验观察周期设置为60s，假如小鼠在1min内并没有成功登上平台，其潜伏期则记为60s，实验前对小鼠进行为期5d训练，潜伏期的缩短可以反映出小鼠记忆能力与学习能力得到了巩固；（2）空间搜索试验：测量小鼠对平台空间位置记忆的保持能力，于定位航行实验的第5d撤除Morris水迷宫内的平台，其他实验方法同定位航行实验，记录120s内小鼠原平台的穿越次数和在原平台所在象限的停留时间。

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Y迷宫实验

在进行正式Y迷宫实验前，首先对小鼠进行1d的学习训练，先将小鼠投入Y迷宫内自由活动，使其适应5min，然后将小鼠放于某一臂内后人工按下仪器按钮，使该臂端成为被电击区域，同时该臂端的灯保持熄灭状态。小鼠被电击后，就会逃至另外两个臂端，当其逃至无电击臂端，证明它逃跑策略正确，反之亦然。每隔半分钟后换一个臂，重复以上操作，连续10次后结束。第2d开始正式实验，重复第1d操作，取消5min的适应时间，直接测试，记录小鼠正确逃跑次数。

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Ｔ型迷宫试验

可以有效地测定动物的工作记忆，有研究认为Ｔ型迷宫没有给予受试动物奖励或采用惩罚措施，即完全利用动物探索的天性，故可以最大可能地降低影响实验结果的混杂因素的作用，但也有研究发现啮齿动物有与生俱来的偏侧优势，即实验动物在Ｔ型迷宫中更倾向于向一边走（或左或右），并且该现象存在种系差异及性别上的差异。

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八臂迷宫实验

通过八臂迷宫实验评估大鼠的空间学习记忆能力。每组选取经过Morris水迷宫实验的10只大鼠，在正式实验开始前进行环境适应性训练2d，每天2次，每次训练10min，以便大鼠熟悉迷宫环境及建立摄食策略。为保证大鼠足够的摄食动力，正式测试前所有大鼠均被禁食24h。将八臂迷宫实验的1、2、4、7号臂放入饲料且固定为喂食臂。观察大鼠10min内的摄食活动并记录大鼠重复进入喂食臂总数为工作记忆错误次数，重复进入非喂食臂总数为参考记忆错误次数，两者之和为总错误次数。每次测试结束后，将八臂迷宫实验用75%乙醇擦拭、晾干，以防止气味信号对大鼠的干扰作用。

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新物体识别实验（NOR）

主要用于检测分析啮齿类动物学习记忆。新物体识别实验和旷场适应用一样的实验箱，选用两个黄色物体，一个正方体一个圆柱体，两个物体除了形状不同外，其他（材质、颜色和平滑程度）完全一致。用摄像机记录下小鼠在旷场中的活动情况，动物运动轨迹跟踪系统可以自动检测和追踪动物的状态和活动情况。实验流程分为三部分：适应期（Habituation）、熟悉期（Training）和测试期（Testing）。适应期（Habituation）：将小鼠放入旷场实验箱中10min，以熟悉实验环境，待10min实验结束后，将小鼠放回鼠笼。每次实验完后应仔细清理箱内粪便和残留物，以避免对下一组实验小鼠造成影响。熟悉期（Training）：在适应期过了30min后，在旷场实验箱中两侧放入两个完全相同的黄色正方体识别物，将小鼠放入旷场实验箱中5min，放入小鼠时注意小鼠的头不能朝向任何一个物体，记录小鼠对左右相同物体的探索情况，待5min实验结束后，将小鼠放回原来的鼠笼。当小鼠的鼻子在≦1cm的范围内指向或用口鼻嗅舔物体均视为探索活动，但小鼠在物体上爬没有用鼻子嗅探物体或身体其它部位接触物体，都不属于对物体的识别活动。测试期（Testing）：在熟悉期过了15min后，将旷场实验箱中其中一个正方体物体换为形状不同，其他都一样的圆柱形物体，并将小鼠放入旷场实验箱中5min，放入小鼠时注意小鼠的头不能朝向任何一个物体，摄像机会记录小鼠对新物体的探索情况，并计算每只小鼠的新物体识别指数（Recognition index）。新物体识别指数=探索新物体的时间/（探索新物体的时间+探索旧物体的时间）×100%。本实验选用以下参数：（1）位置偏好：Location preference(%)；（2）新物体识别指数：Recognition index(%)。

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条件恐惧实验

恐惧箱实验（Fear Test）又称条件恐惧实验，是检测啮齿类认知功能常用的行为学研究手段，啮齿类动物在恐惧时会表现出特有的冻结（Freezing）行为状态，在这种情况下啮齿类动物倾向于保持僵直或者静止不动的防御姿势。通过恐惧刺激（如电击）与特殊环境(如金属底板，颜色背景)或适度刺激(如刺耳的声音)的相关性记忆，根据啮齿类动物对环境和声音刺激表现出的恐惧反应，可推测其恐惧性学习记忆能力。恐惧箱实验分为三个阶段，每个阶段间隔24小时。(1)学习阶段:第一天先将小鼠放在恐惧箱中，开黄灯适应2min后，检测小鼠在恐惧箱中3min冻结行为的基础阈值（Baseline），然后发出2Hz脉冲音(80dB，3600Hz)，持续30s，在最后2s给小鼠足部电击刺激(0.7mA，2s)，休息2min后，重复前面的声刺激和电刺激，一共重复5次声刺激和电刺激。在最后一次配对刺激后，让小鼠在恐惧箱内停留30s使其充分记住环境，在放回鼠笼。(2)环境记忆测试:在学习阶段过去24小时后，将小鼠再次放回和第一天环境相同的恐惧箱待6min，不给予任何刺激，记录小鼠在恐惧箱中冻结行为的持续时间s（Same Context）。(3)声音记忆测试:在第一次刺激过去48小时后，改变恐惧箱内的环境（Novel Context），视觉上，将黄灯变为绿灯，墙面贴上有格子图案的墙纸；触觉上，将金属底部变为木质底板；味觉上，在周围涂上柠檬汁改变气味；另外实验人员要变换，手套由蓝色换为绿色。将小鼠放入新的恐惧箱中待3min，期间不给予任何刺激；3min后给予第一天的声刺激，持续3min，观察记录小鼠的冻结行为持续时间。检测记录不同环境中小鼠静止行为的总时间用于评估认知功能。本实验选用以下参数：1.冻结的持续时间（s）：Duration of Freezing(s)。

记忆分为程序性记忆和陈述性记忆。程序性记忆又称为内隐性记忆或反射性记忆，是对运动技能、感知觉、程序和规则等的记忆，具有自主或反射的性质，这种记忆形成缓慢，需要多次重复和演习才能完成。程序性记忆的完成不需要有意识的回忆过程，一旦形成即可保持较长时间。常见的程序性包括斯金纳箱、触屏奖赏、穿梭实验等。在穿梭实验中，给予某一特定信号（如灯光、声音等），若动物在规定时间内对不发生反应，立即给予惩罚性刺激（电刺激为主），动物为了躲避电击会穿梭至对侧安全区（被动条件反射），经过反复训练后（一般连续5d）则可形成将特定信号与惩罚性刺激结合起来的条件反射－主动逃避反应（主动条件反射），是一种高级、复杂的联想式程序性记忆的获得与巩固过程。

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避暗实验

该实验装置由暗室、明室两部分组成。两室之间有圆洞，可供小鼠通行，底部均铺通电不锈钢栅。造模后第12d进行该实验，将小鼠背向洞口放入明室，动物通过洞口进入暗室受到电击后取出，24h后重做测试，记录动物300s内首次遭到电击时间即潜伏期遭受电击次数即错误次数。

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穿梭箱

实验开始时首先设定实验参数，包括安全期( 非条件刺激与条件刺激之间的间隔时间) 、条件刺激( 高频率的稳定声音刺激或者闪光灯强光刺激) 时间、非条件刺激(电击) 时间及强度、穿梭次数等。在记忆获得阶段首先把实验鼠放入左侧室，接近并面向端壁，适应 5 min 后开始训练。穿梭实验视频分析系统按照预先设定好的程序，先给一个可以察觉的条件刺激，持续一定时间后，如果实验鼠仍停留在同侧，则再给一个非条件刺激。动物受到电击后将从圆洞逃至对侧一定时间后，对侧再给予条件和非条件刺激，如此反复。每只鼠连续训练 10 d，每天穿梭几十次。一次穿梭训练结束后，间隔一定时间开始下一次训练。经过反复训练后，只给条件刺激，动物即逃到对侧安全区以逃避电击，此即形成了条件反射或称主动回避反应。全部训练结束后，计算机显示出每次穿梭的轨迹，记录大(小) 鼠的主动回避反应 ( active avoidance response，AAR，即动物在条件刺激后，非条件刺激到来之前就产生的穿梭) 次数; 被动回避反应(passive avoidance response，PAR，即实验鼠在非条件刺激后才产生的穿梭) 次数; 逃避失败 (escape failure，EF，指实验鼠在条件刺激和非条件刺激的过程中仍然停留在同侧箱中) 次数。以 AAR 作为其学习记忆成绩的主要评价指标，并计算主动回避反应率(rate of AAR，ROA，即主动回避反应次数AAR占穿梭总数N的百分比) ，统计ROA ＞ 0. 75(达标) 的动物的百分比。

操作条件反射根据条件刺激的不同，可分为操作式防御性条件反射和奖赏操作条件反射。操作式防御性条件反射是给以刺激信号（如灯光或声音），随即给予动物足部电击刺激（惩罚性刺激），动物进行操作，踩踏板或拉杠杆，则能够断开电路以避免或终止电击，这样通过训练，使动物能够结合刺激信号，习得通过操作行为预防或终止伤害性刺激（如电刺激）建立操作条件反射。奖赏操作条件反射以能引起奖赏效应的物质（食物、糖水等中性强化物质）作为非条件刺激信号，动物通过对踏板的偶然触碰，发现了踏板操作能获得奖励物质（固体或者液体物质），多次之后，最后动物学会了踏板获得奖赏这一行为，形成简单的操作行为反应－结果之间的操作条件反射。

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