湖北
摘要：PCR（聚合酶链式反应）已成为生物科学、诊断和法医学领域极具价值的技术之一。本文回顾了 PCR 的发展历史，包括从最初的发明到不断改进的过程；介绍了其在生物科学中的广泛应用，涵盖疾病诊断、法医学等多个领域；探讨了基于微流控平台的 PCR小型化发展，以及由此衍生出的如数字 PCR 等技术；还分析了 PCR 面临的挑战与商业化进程。展望未来，PCR 在分子诊断等领域将发挥更重要的作用，微流控技术和 POC 检测的发展将进一步拓展其应用范围。
一、PCR 技术的发展历程
PCR 技术的发明是生物学和遗传学研究的重大突破。最初，Mullis 发现桑格测序法在检测单拷贝基因时信号微弱，通过添加变性步骤和反向引物，实现了 DNA 拷贝的扩增，但当时每轮 PCR 都需添加聚合酶，操作繁琐。随后，“Baby Blue” 自动化系统解决了这一问题（图 1A）。
利用水生栖热菌的Taq 聚合酶（能耐受 94°C 高温），无需每次添加新鲜聚合酶，推动了 PCR 技术的发展。同时，出现了自动时域温度循环仪和空间域系统（图 1B），目前时域系统更为常用（图 1C）。
二、PCR 在生物科学中的应用
PCR 最初用于检测导致镰状细胞贫血的 HBB 基因突变，通过放射性标记寡核苷酸杂交和限制性分析来寻找遗传突变，β - 珠蛋白基因序列成为首个酶促扩增对象（图 1D）。
在此基础上，PCR 技术不断拓展应用领域。在临床遗传学和微生物学中，用于检测病毒和细菌感染等；在法医学中，通过多重 PCR 分析多态性微卫星位点，实现对微量人类 DNA 的分析（图 1E、1F、1G）。实时定量 PCR（qPCR）和逆转录 PCR（RT - PCR）的出现，使其成为核酸定量分析的金标准。
三、基于微流控平台的 PCR 小型化
微流控技术推动了 PCR 设备的小型化发展，出现了多种基于微流控的 PCR 系统。
液滴式系统：将样品分割成液滴，在微流控通道中进行细胞裂解、DNA 提取、PCR 和荧光检测等操作，常用于单细胞研究（图 2C）。
芯片式系统：通过微加工制造不同结构的芯片，样品在芯片的孔或通道中进行 DNA 扩增，具有便携性和快速性（图 2D）。
混合系统：将 PCR 主混合液分配在固定位置，形成虚拟反应室，进行热循环和荧光检测 （图 2E）。
四、从 PCR 衍生出的技术
数字 PCR（dPCR）：基于微流控技术，将 PCR 样品分割成数千甚至数百万个子样本，可实现 DNA/RNA 拷贝数的绝对定量，包括液滴式数字 PCR（ddPCR）和芯片式数字 PCR（cdPCR）（图 2A）。
等温扩增：如环介导等温扩增（LAMP）和重组酶聚合酶扩增，无需温度循环，设备设计更简单，功耗更低，还可结合 CRISPR - CAS 系统检测扩增产物 。
五、PCR 面临的挑战
PCR 的实际应用效果受样品质量影响很大，样品中存在的多种PCR 抑制剂会导致假阴性结果或提高检测限。此外，富含 GC 的 DNA 序列扩增困难，因为会形成二级结构阻碍变性和引物退火。PCR 设备的小型化也面临挑战，需要有效分离和预浓缩低体积样品，以达到与传统实验室相当的灵敏度。
六、PCR 的商业化进程
PCR 的商业化主要体现在自动化仪器和高性能试剂的发展。许多公司参与其中，推动了 PCR 技术的普及和应用。基于微流控平台的 PCR 系统，如 Cepheid 的 GeneXpert，实现了从样品到结果的一站式操作；数字 PCR 技术也实现了商业化，其微流控系统可处理超过 100 万个样本。
七、PCR 的未来展望
PCR 在下一代测序（NGS）等技术中不可或缺，未来在分子诊断领域将发挥更重要作用。微流控技术将实现手持 POC 系统的平行多样本分析，可用于分析免疫磁外泌体 RNA、单细胞 mRNA 和 miRNA 等。纸基 PCR 或 LAMP 系统将在分子诊断中得到广泛应用，法医学也将实现现场 DNA 分析。此外，PCR 诊断系统可能联网形成 “物联网”，便携式 dPCR 系统将用于临床诊断、法医学和环境研究等领域。
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