Adv Sci | 血浆DNMT1活性可用于乳腺癌肿瘤负荷评估及新辅助治疗效果预测

乳腺癌作为女性恶性肿瘤中发病率最高的疾病，已成为威胁女性健康和公共卫生体系的重大难题【1, 2】。在过去数十年里，针对乳腺癌的诊断和治疗技术不断进步，这其中新辅助治疗已成为局部晚期乳腺癌患者的标准治疗方案之一【3, 4】。然而，用于评估肿瘤负荷和预测治疗反应的液体活检标志物仍有待进一步开发。DNA 甲基化由 DNA 甲基转移酶（DNMTs）介导，其活性的稳定性对细胞命运具有关键意义【5】。其中 DNMT1 在复制过程中对半甲基化 DNA 链进行修复性甲基化【6, 7】，相较于肿瘤细胞的表型变化（如增殖、迁移、侵袭等），DNMT 介导的表观遗传改变在时间上处于更前端，被认为是最具研究前景的靶点之一。

目前临床上检测 DNMT1 主要依赖酶联免疫吸附实验（ELISA）或组织病理学免疫组化（IHC）。这两种方法在敏感性、定量和侵入性方面均存在局限，并不适用于外周血中的DNMT1检测，且蛋白浓度不能有效反应其活性浓度【8-10】。因此，建立一种能将静态基线预测转化为诊断及治疗过程早期动态评估的高效血浆 DNMT1 检测方法，对于改善乳腺癌患者的预后和生存率具有重要意义。

近日，陆军军医大学第一附属医院高铭萱、齐晓伟及陈鸣团队在Advanced Science杂志在线发表了题为Plasma DNMT1 Activity for Assessing Tumor Burden and Predicting Neoadjuvant Therapy Response in Breast Cancer的文章。这种名为 DIVA（DNMT1 Identification by Variable Activity）的反应系统，该检测技术以血浆 DNMT1 用作乳腺癌临床肿瘤负荷评估及新辅助治疗响应预测的监测指标，为乳腺癌的诊断以及治疗检测提供了全新视角。

在该系统中，作者设计了一段双链 DNA序列，其中中央区域包含两个错位的半甲基化 CpG 位点，作为 DNMT1 反应的底物，而其余所有胞嘧啶均为全甲基化状态。在第一个模块中，DNMT1 可识别半甲基化 CpG 并催化胞嘧啶甲基化，但由于 DNMT1 活性有限，部分底物无法完全甲基化。随后产物进入第二模块，在重亚硫酸氢盐的作用下发生脱氨作用，未甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则保持不变。接着，在第三模块中，这些尿嘧啶在 Afu 尿嘧啶 DNA 糖基化酶（Afu UDG）和核酸内切酶 IV（endo IV）的作用下被断裂。通过这种设计，DNMT1 的活性差异被成功地转化为 dsDNA 浓度的差异，进而可通过 PCR 实现高效快速识别。DIVA 的检测灵敏度可低至10⁻⁷ U/mL，足以直接检测乳腺癌患者血浆中的 DNMT1 活性，这是此前未曾报道的突破。DIVA 的检测周期约为6小时（从样本采集到获得结果），相比免疫组化分析大大缩短了检测时间，显著减轻了患者负担，同时单个样本的检测成本仅为1.5美元。

基于此检测技术，作者进一步开展了前瞻性临床研究，用于乳腺癌患者的肿瘤负荷评估。该研究首先纳入了150名不同分期的乳腺癌患者及对照人群，结果发现DNMT1 活性（以 qPCR 的 ΔCT 值表示）与肿瘤分期呈显著相关性。随着肿瘤分期的升高，DNMT1 活性呈显著上升趋势。具体而言，健康组的 DNMT1 活性最低（ΔCT = 1.32，四分位间距 IQR：-0.02 – 1.78），纤维腺瘤组与健康组相比无显著差异（ΔCT = 1.44，IQR：0.05 – 1.82）。而在乳腺癌患者中，早期组的 DNMT1 活性明显升高（ΔCT = 1.61，IQR：1.07 – 2.35，P = 0.00546），中期组进一步升高（ΔCT = 2.92，IQR：1.57 – 3.86，P < 0.0001），晚期组达到峰值（ΔCT = 3.76，IQR：3.13 – 5.81，P < 0.0001）。此外，我们还收集了 6 例乳腺炎患者的样本，发现其 DNMT1 活性与健康人群相比无显著差异。进一步招募的121名患者与健康对照证实该检测技术的整体预测能力的 AUC 值为 0.874（95% 置信区间：0.809–0.938，P < 0.0001，n = 97），尤其是对晚期乳腺癌的预测能力最强（AUC = 0.998，95% CI：0.992–1.00，P < 0.0001，n = 32），显示出优异的预测性能。

为阐明血浆DNMT1活性升高机制，该研究对59例乳腺癌患者组织芯片进行免疫组化分析，比较癌组织与配对邻近组织的DNMT1表达。结果显示癌细胞核内DNMT1显著过表达，而邻近组织表达明显偏低。根据IHC评分将样本分为高（>1.5）、中（0.5–1.5）和低（<0.5）三组，肿瘤组织的高表达比例（28.3%）远高于邻近组织（0.9%）。随着肿瘤分期从早期到末期，高评分比例逐步上升至64%，低评分比例则由61%降至7%，这一趋势与血浆中DNMT1活性变化高度一致。

鉴于血浆DNMT1活性随肿瘤分期进展而升高，研究假设治疗成功后DNMT1活性下降，可作为疗效监测标志物。作者纳入了22例接受不同新辅助治疗的II期浸润性导管癌患者，分别在治疗前后采集血浆检测DNMT1并匹配超声结果，同时依据疗效将患者分为CR（完全缓解）、PR（部分缓解）、SD（病变稳定）以及PD（病变进展）四组。代表病例显示，CR/PR组治疗后DNMT1活性明显下降，CR组DNMT1由2.61（IQR 1.65–2.96）降至0.79（IQR 0.59–0.93）；PR组由2.24（IQR 1.77–2.48）降至1.24（IQR 1.16–1.40）；SD组变化不显著，PD组由1.01（IQR 0.80–1.75）升至1.89（IQR 1.12–1.92），上升约1.9倍。该变化幅度与超声测得的肿瘤长度变化高度一致。而这也是首次利用血浆DNMT1动态监测新辅助治疗反应。该方法敏感、非侵入，同时血浆DNMT1活性变化可有效预测乳腺癌新辅助疗效。

DNMT1在DNA复制时修复半甲基化链，其介导的基因组甲基化变化早于肿瘤细胞表型改变。本研究构建了由甲基化、脱氨和切割三模块组成的DIVA系统，将不同DNMT1活性转化为底物断裂差异，通过qPCR实现超高灵敏检测，同时做到时间与检测成本间的可控。临床样本的分析表明，血浆中DNMT1活性与乳腺癌分期及肿瘤负荷高度相关，并与组织IHC结果相符；新辅助治疗的患者监测结果显示，治疗响应良好者DNMT1水平显著下降，而响应不佳者则无明显变化或升高。因此血浆DNMT1活性有望成为新型的乳腺癌生物标志物，而DIVA可作为早期诊断、肿瘤负荷评估及疗效监测的有效辅助工具。

原文链接: https://advanced.onlinelibrary.wiley.com/doi/epdf/10.1002/advs.202501064

制版人：十一

参考文献

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