肿瘤干性泛癌分析！单细胞+转录组公共数据挖掘还能发10分+吗？！思路值得借鉴！

虽然免疫检查点抑制剂（ICI）被认为是肿瘤的突破治疗的突破口，但是只有少部分患者能从中获益。肿瘤干性可能是免疫检查点抑制剂耐药性的潜在罪魁祸首，但缺乏直接的临床数据。2022年4月，Genome Medicine杂志发表题目为Integrated analysis of single-cell and bulk RNA sequencing data reveals a pan-cancer stemness signature predicting immunotherapy response的研究论文，通过单细胞和常规转录组数据挖掘揭示肿瘤干性与免疫治疗耐药性之间的强大联系，并开发出一种有前景的生物标志物，为克服免疫检查点抑制剂耐药性提供启示。

1.肿瘤干性与免疫检查点抑制剂耐药相关

对两个单细胞数据集黑色素瘤 (GSE115978)和基底细胞癌 (GSE123813)进行数据分析，并用CytoTRACE对细胞群的进行干性评分。然后利用应答 (R)和非应答 (NR)数据对细胞群进行注释 (FigA、C)，通过聚类图和箱线图 (FigB、D)的对比，验证了前人的研究结论：NR组表现出更高的肿瘤干性。

2.单细胞泛癌筛选干性signature

通过把干性分数正相关的基因 (Gx)与恶性细胞中上调的基因 (Gy)取交集，并计算34个scRNA-Seq数据集 (G1-G34)各基因Spearman R的均数 (Fig2A)，把Spearman R大于0.4的基因筛选出来，组成肿瘤细胞干性signature。

对干性signature进行富集分析，主要富集在缺氧、糖酵解、泛素化、EPH-肾上腺素信号通路、WNT信号通路和核苷酸切除修复 (NER)等过程上 (Fig2B)。其中一些基因已被报道与免疫治疗不良结果有关，如EPHA3, EPHA7, ENO1, ACTG1, DKK2, NPM1和BCL10。

3.利用TCGA泛癌数据分析干性signature与免疫抑制之间的关系

在TCGA的30种不同种类型中，对干性signature和75种免疫相关基因进行彻底的分析，干性signature和免疫相关基因的表达水平之前普遍存在负相关 (Fig3A)。然后评估免疫细胞的渗透状态，以更好地表征肿瘤免疫微环境 (TIME)。高表达干性signature的肿瘤细胞免疫细胞减少，包括CD8+ T 细胞、NK细胞和巨噬细胞 (Fig3B)。上述结果表明，干性signature与抗肿瘤免疫呈现负相关。

把干性signature和10个与较差的免疫应答Hallmark相关通路进行相关分析 (Fig3A)，结果显示干性signature与大部分通路呈正相关。然后用干性signature与ITH和TMB进行相关分析 (Fig3D、Fig3E)，结果显示干性signature与ITH和TMB呈正相关。

TMB越高，免疫治疗效果越好，与Fig3E图中干性signature与 TMB呈正相关结果冲突。为了更好地阐述 TMB与肿瘤干性的关系，作者根据干性signature和 TMB得分的中位值进行分组，共分为高肿瘤标志物/高TMB (HSHT)、高肿瘤标志物/低TMB(HSLT)、低肿瘤标志物/高TMB (LSHT)和低肿瘤标志物/低TMB (LSLT)等四个亚组。补充文件中A和B图，结果显示，高肿瘤干性 (HS)可以促进免疫抵抗和逃避，跟低TMB水平 (LT)则与抗原性缺乏导致的抗肿瘤免疫降低有关预期的那样，HS组和LT组的细胞毒性淋巴细胞的浸润都减少了。补充文件中C图，结果表明，LSLT的细胞毒性淋巴细胞水平高于HSHT。综上所述，无论TMB水平如何，低干性signature的肿瘤比高干性signature的肿瘤表现出更好的肿瘤免疫。

4.用干性signature去预测免疫治疗结果

用7种机器学习算法对模型进行训练，并对每个模型进行重复10次的5折交叉验证进行参数优化。分析发现，贝叶斯模型 (nb)模型验证结果最好 (Fig4A、4B)。然后用预测效果最好的nb模型在验证集和测试集中进行验证 (Fig4C、4D)。

对干性signature进一步分析，与先前signature在泛癌和黑色素瘤中进行比较，发现干性signature的AUC值保持在前三 (Fig5A、5B、5C)。

5.利用CRISPR筛选数据探索干性signature潜在治疗靶点

系统地收集了7个CRISPR队列中基因敲除基因的免疫应答数据，根据这些CRISPR队列中使用的模型细胞和治疗条件，进一步将其划分为17个数据集 (Fig6A)。这些CRISPR数据库共记录了22,505个基因。作者根据基因的平均z分数对基因进行排序，排名靠前的基因属于免疫抗性基因，基因敲除后促进抗肿瘤免疫。排名靠后的是免疫敏感基因，在基因敲除后会抑制抗肿瘤免疫。通过比较干性signature和其他预测的signature在top1%，2%，3%中的比例 (Fig6B)，发现干性signature占比更高，干性signature更有可能是免疫耐受基因。20个干性signature基因进入了top3%，20个干性signature通过多个独立的CRISPR数据集 (Fig6C)得到验证，这些干性signature可能成为与ICB协同治疗的潜在靶点。

作者巧妙地利用单细胞和转录组的公共数据，通过对免疫治疗和肿瘤干性进行综合分析。文章有许多值得借鉴的地方，比如，作者将单细胞数据和转录组数据结合起来用，而不是只用单细胞数据或转录组数据。因为单细胞敏感，但是有时可靠性差，这是单细胞技术上的局限；转录组测序成熟，但是敏感性和精确性不如单细胞测序。希望各位果友能从这篇文章中得到启发，早日发表自己的文章。

单细胞公共数据挖掘，除了联合常规转录组分析外，还可以借助表型联合分析的方式，如铁死亡+EMT等。当然，现在发表纯生信是不可能了，需要实验验证了。