Protein & Cell | 徐安龙/付永贵团队开发蛋白液-液相分离调控因子筛选新工具

蛋白质液-液相分离（LLPS） 是指蛋白质和 RNA 等生物大分子通过弱相互作用形成动态、可逆的无膜凝聚体的过程。这一现象广泛参与 RNA 转录与代谢、蛋白质降解和信号传导等细胞过程，并与神经退行性疾病和癌症等疾病密切相关。然而，目前针对目标蛋白的 LLPS 调控因子的高通量筛选方法仍然相对缺乏，限制了对 LLPS 在生理及病理过程中作用的深入研究。

近日，徐安龙/付永贵团队在 Protein&Cell上发表了题为BiFC and FACS-based CRISPR Screening Revealed that QKI Promotes PABPN1 LLPS in Colorectal Cancer Cells的研究论文。本研究开发了一种基于CRISPR/Cas9的全新筛选策略，结合双分子荧光互补（BiFC）技术与荧光激活细胞分选（FACS）技术，实现对调控蛋白 LLPS 关键因子的高通量筛选，并揭示了肿瘤抑制因子QKI在PABPN1 LLPS及结直肠癌进程中的重要作用。

PABPN1作为一种3’末端加工因子，可以抑制近端poly(A)位点的使用，在可选择性多聚腺苷酸化调控中起着重要作用。PAPBN1可以通过相分离调控APA和结直肠癌发生发展的。为了筛选 LLPS的 关键调控因子，作者首先将Venus分段与PABPN1相连，验证了 BiFC 标记的PABPN1仍能够正常发生 LLPS，并且其相分离程度与荧光信号强度呈正相关。随后，通过敲低PABPN1相分离的负调控因子SNRPD2，证明了负调控因子的表达量与PABPN1-BiFC的荧光强度显著负相关，说明BiFC/FACS可以用来筛选相分离的调控因子。作者构建了靶向1484种RNA 结合蛋白的sgRNA 文库，并通过FACS 筛选最高、低荧光强度（10%）的细胞群，之后经过NGS测序成功鉴定出一系列影响 PABPN1 LLPS 的关键因子。

在筛选出的候选因子中，肿瘤抑制因子 QKI可通过与PABPN1相互作用，增强PABPN1的RNA结合能力从而促进其相分离。值得注意的是，QKI在结直肠癌细胞中的表达水平降低，且其核定位减少，这直接破坏了 QKI 与 PABPN1 之间的相互作用，进而影响 PABPN1的LLPS。通过恢复QKI的核定位（过表达 QKI-NLS 突变体），可以显著增强 PABPN1 的相分离能力，并有效抑制癌细胞的增殖与迁移。此外，作者通过亚砷酸盐处理诱导QKI-6 出核，观察到 PABPN1 LLPS 及其与 QKI 之间的相互作用均显著减弱，进一步验证了 QKI的核定位对PABPN1 LLPS 的调控作用。

最后，作者发现QKI通过LLPS介导的APA调控在结直肠癌中发挥关键作用。QKI 表达降低会破坏其对 PABPN1 相分离的调控，进而影响APA选择，最终促进癌细胞的增殖和迁移。这一新机制不仅揭示了 LLPS 在癌症进程中的功能，还为结直肠癌的早期诊断及治疗靶点开发提供了潜在思路。

本研究开发的高通量 CRISPR 筛选方法为 LLPS 调控因子的系统性研究提供了一种高效工具。利用这一策略，作者成功鉴定出QKI 作为 PABPN1 LLPS 的关键调控因子，并揭示了其在结直肠癌进程中的重要作用。未来，该技术有望被广泛应用于 LLPS 调控网络的研究，为揭示 LLPS 在疾病发生发展中的机制以及开发相关精准治疗策略提供基础支持。

https://doi.org/10.1093/procel/pwaf022

制版人：十一

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