华东理工许建和等人代谢工程改造毕赤酵母，高效合成α-红没药醇

α-红没药醇是一种天然倍半萜类化合物，因其皮肤愈合、防腐、抗炎和抗菌特性被广泛应用于化妆品和制药行业。商业化的 α-红没药醇主要通过蒸馏来自各种植物来源的精油生产，但该方法受到季节波动、净化成本高和产量低的限制。

随着合成生物学技术的发展，天然产物的生物合成越来越受到关注。此前，科学家通过异源甲羟戊酸 （MVA）途径在工程大肠杆菌中实现了 α-红没药醇的生物合成，滴度为 23.4 g/L；江大团队最近开发了一种粘质沙雷氏菌底盘，α-红没药醇的滴度达到 30.2 g/L。

近日，华东理工大学许建和团队通过代谢工程改造毕赤酵母，实现了 α-红没药醇的高效生产。通过 MVA 途径优化、多拷贝整合、NADPH 供应增强和分子伴侣工程改造，在 5 L 补料发酵罐中 α-红没药醇产量达到 32.8 g/L，为高效萜类生物合成提供了新的思路。相关研究以题为“Reprogramming Komagataella phaffii for a Robust Chassis toward Efficient De Novo Biosynthesis of (−)-α-Bisabolol”发表在Journal of Agricultural and Food Chemistry。

此前，有其他研究人员通过在毕赤酵母基因组上过表达了来自酿酒酵母的同源重组（HR）相关基因，得到稳健的细胞工厂 PpHR3。因此，研究人员以 PpHR3 作为初始菌株，分别测试了来自母菊（Mr BBS）和菜蓟 (Cc BBS) 的 α-红没药醇合酶的效率，发现菌株 KB-01（表达 Cc BBS）发酵 120 h 后，检测到 α-红没药醇滴度为 7.25mg/L，比菌株 KB-02 高 64.3%，该菌株被用于后续 α-红没药醇生物合成的优化。

优化 MVA 途径优化 α-红没药醇生物合成的滴度。在毕赤酵母中，乙酰辅酶 A 通过 MVA 途径转向 FPP（法呢基二磷酸），FPP 在 α-红没药醇合酶催化下转化为 α-红没药醇。已发现提高 MVA 通量是提高萜类化合物生物合成滴度的有效策略。因此，研究人员过表达了所有 MVA 途径相关基因，并评估它们对 α-红没药醇生物合成滴度的影响。

结果显示，过表达 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶 A 还原酶 (HMG1)的菌株KB-05 ，α-红没药醇产率达到 18.8 mg/L。HMG1是位于内质网（ER）的整合膜蛋白，过量表达的完整 HMG1 会引起内质网堆积，有较多报道显示 N 端膜结合域的截短可使 HMG1 稳定在胞质中，明显提高萜类化合物的滴度。通过截断 HMG1（tHMG1），菌株 KB-06 的 α-红没药醇滴度显著提高，达到 86.0 mg/L。

另外一个过表达 MVA 途径中的限速酶异戊烯基二磷酸异构酶（IDI）的菌株 KB-10，α-红没药醇产量达到 28.8 mg/L。IDI 可以协调异戊烯基焦磷酸（IPP）与其异构体二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）的比例，从而减轻 DMAPP 的细胞毒性。

通过自切割肽 2A 在单个位点进行多基因表达，最终，同时过表达这两个关键基因的菌株 KB-12，α-红没药醇最终产量显著提高至 171 mg/L，是初始菌株的 24 倍。

通过增加拷贝数增强产物表达。增加 Cc BBS基因的拷贝后，菌株 KB-13 的 α-红没药醇产量达到 240 mg/L，比亲本菌株 KB-12 高 49.1%。研究发现，使用柔性连接肽将 Cc BBS 与 ERG20 融合可以显著提高 α-红没药醇的产量。以菌株 KB-16 为基础，构建了 ERG20-(GS)4-Cc BBS 的多拷贝整合，分别产生了菌株 KB-19（2 拷贝的融合蛋白）和 KB-20（3 拷贝的融合蛋白），菌株 KB-19 的 α-红没药醇滴度最高，高达 1102 mg/L。

增强体内 NADPH 供应。NADPH 是萜类化合物生物合成的还原驱动力，甲醇解离途径提供丰富的 NADH，研究人员过表达内源性 NADH 激酶 POS5，将其转化为 NADPH。最终表达完整内源性 POS5，α-红没药醇滴度达到 1486 mg/L。

过表达分子伴侣和转录因子促进产物合成。转录因子在调控相关基因表达中起着重要作用；分子伴侣可以帮助其他蛋白质正确折叠和有序组装。过表达转录因子和分子伴侣通常用于缓解细胞应激并促进蛋白质功能表达。内质网中的蛋白质折叠是一个氧化过程，依赖于蛋白质二硫键异构酶 (PDI1) 和内质网氧化酶 1 (ERO1)。表达内源性 ERO1 的菌株 KB-30，α-红没药醇滴度达到了1877mg/L。

为了评估 KB-30 的工业应用潜力，采用补料分批法在 5 L 发酵罐中进行扩大规模发酵。通过切换碳源，采用两阶段发酵工艺，用于细胞生长（阶段I）和α-红没药醇积累（阶段II）。118h 后，α-红没药醇产量提高到 32.8 g/L，为目前报道的 α-红没药醇从头合成的最高产量。

1.https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jafc.4c11904

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