Plant Journal | 华南农业大学胡宇飞课题组利用CRISPR/Cas9技术实现T-DNA的定点插入

位点特异性DNA插入（site-specific DNA insertion）是转基因作物育种和基因功能分析的重要工具，可以将功能性元件插入特定基因组位点，并可以避免插入基因在染色体不同位置所带来的表达差异。在过去几十年里，许多努力未能实现令人满意的效率。传统的位点特异性DNA插入方法基于同源重组修复（homology-directed repair，HDR）机制，然而，植物细胞中HDR的低活性使得需要多个世代，筛选大量转基因后代，因而低效。与HDR介导的插入低效相比，农杆菌介导的T-DNA整合效率高，是植物转基因的主要手段。然而，T-DNA整合依赖非同源末端连接（non-homology end joining, NHEJ）途径，在植物基因组中的插入位点具有随机性。

近日，华南农业大学生命科学学院胡宇飞课题组在Plant Journal上发表题为Efficient targeted T-DNA integration for gene activation and male germline-specific gene tagging in Arabidopsis的研究论文。该研究开发了一种CRISPR/Cas9介导的拟南芥靶向T-DNA插入的方法，该方法比HDR介导的方法更快速、高效，并以此开发了基因激活和雄性生殖细胞特异性基因标记两种应用。

基因激活通过在T-DNA的LB端设置CaMV35S启动子，定点插入激活特定的下游基因。

图1. CRISPR/Cas9介导的T-DNA定点插入

利用该技术实现了FT和MYB26的激活，显著增加了转录表达，分别导致早花和花药内壁次生壁增厚模式的改变。

图2. T-DNA定点插入实现基因激活

雄性生殖细胞特异性基因标记的T-DNA中包含两个报告基因，即NeoR和MGH3::mCherry，有助于创建定点插入突变体，简化突变等位基因的遗传分析，并可对受精过程的生殖细胞进行活体追踪。该研究成功地将该系统应用于靶向精细胞特异表达，参与精卵识别的基因GEX2。

图3. T-DNA定点插入实现雄性生殖细胞特异基因标记

生命科学学院硕士研究生许鹏和分析测试中心黄吉雷高级实验师为共同第一作者，许鹏完成T-DNA定点插入主要实验，黄吉雷完成电镜细胞形态学观察和体外受精实验。生命科学学院胡宇飞副教授为通讯作者。庄楚雄教授对论文有贡献。本文得到了国家自然科学重点基金，广东省自然科学基金等项目的支持。

论文链接：

http://dx.doi.org/10.1111/tpj.70104