北京
脂质代谢稳态是机体健康的重要保证。植物来源外泌体样囊泡（ELNs）与动物外泌体的结构和功能相似，是一种直径约40～200 nm的囊泡，具有磷脂双分子层结构，呈茶托状，富含脂质、蛋白质和核酸等活性分子，具有维持细胞稳态和免疫调节功能。已有研究从大豆中成功提取ELNs，且大豆外泌体样囊泡（SELNs）中的miR-5781可靶向人源白介素-17A，在炎症反应中起关键作用。
秀丽隐杆线虫是脂质代谢研究的重要模式生物之一，其与哺乳动物之间的关键代谢途径大部分是保守的，包括脂肪酸合成、氧化、不饱和链伸长及胰岛素信号通路等。同时，线虫体内脂滴合成所需时间较短且可视化。棕榈酸及其盐可诱导细胞脂质代谢紊乱，以模拟肥胖等疾病的生理过程。
南京财经大学食品科学与工程学院的高铭蔚、张梓文、朱珍珠*等拟从大豆中分离提取SELNs分析其主要成分，评估SELNs在体外消化模拟环境下的稳定性；采用棕榈酸钠（SP）诱导高脂线虫，通过油红O或尼罗红染色及TG定量分析检测SELNs对脂滴沉积的影响；同时利用聚合酶链式反应（PCR）分析SELNs对线虫体内脂质代谢相关基因表达的调控作用，探讨SELNs调节脂质代谢的作用机制。本研究旨在为开发具有降脂功能的植物基ELNs奠定基础，同时拓展大豆衍生功能食品的应用范围。
01
SELNs的结构表征
采用超速离心和蔗糖密度梯度离心相结合的方法，从大豆中提取出SELNs，其在30%和45%蔗糖溶液中的沉降带如图1A所示。TEM结果显示，SELNs为杯状囊泡，具有双层膜结构（图1B）。NTA数据显示，SELNs平均粒径为（163.00±2.30）nm（图1C）。DLS分析结果显示，SELNs平均水合粒径为（273.13±10.09）nm（图1D），与文献报道的粒径分布相近；SELNs的Zeta电位为（-15.77±0.68）mV（图1E），且PDI＜0.30。经测定，每100 g大豆可提取得到1 g SELNs冻干粉，提取率可达1%。通过分析SELNs主要成分含量可知，每克SELNs冻干粉中含有蛋白质200 mg、脂质9 mg、RNA 57.14 μg。
02
SELNs的主要组分分析
基于LC-MS非靶向的方式对SELNs脂质提取物进行检测，共鉴定出40 种脂质（图2A）。其中，TG在总脂质中含量占比最高（28.82%），磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰胆碱（PC）和甘油二酯（DG）在总脂质中含量占比均超过10%。SDS-PAGE结果显示，SELNs含有的蛋白质分子质量主要分布在10～95 kDa之间（图2B）。琼脂糖凝胶电泳结果显示，加入SELNs核酸样品后，100～250 bp处出现明显的信号条带；向核酸样品中加入核糖核酸酶后信号条带消失（图2C），说明SELNs样品中含有的核酸主要为RNA，这与文献中报道的结果一致。
03
SELNs的稳定性分析
为了评估SELNs在消化液中的稳定性，分析了体外消化模拟液中SELNs的水合粒径、Zeta电位及形貌变化。如图3A、B所示，与空白组SELNs水合粒径相比，在唾液淀粉酶作用的情况下，颗粒的水合粒径无明显变化；Zeta电位为-12 mV，具有良好的稳定性。经胃消化0.5、1、1.5、2 h，消化液中颗粒的水合粒径逐渐变大，这有可能是SELNs在胃蛋白酶和酸性环境下发生聚集导致。酸性pH值和消化酶可能会使SELNs囊泡表面蛋白构象发生改变，多肽链去折叠而暴露疏水区域，从而使粒径增大；同时，在较低的pH值条件下，氢离子与SELNs表面亲水端结合，从而促进SELNs粒径逐渐增大、Zeta电位减小。进入肠消化阶段，消化液中颗粒的水合粒径又逐渐恢复至与空白组相近的水合粒径和Zeta电位，可能是胰酶与胆盐迅速发生反应，将SELNs表面结合的氢离子进一步解离。采用亲脂性染料PKH67标记SELNs，通过荧光成像技术监测不同时间段SELNs的形貌变化。如图3C所示，SELNs在口腔消化模拟液中保持囊状结构；在胃消化模拟液中囊泡虽然有变大趋势但没有破裂；在肠消化液中，囊泡逐渐减少。以上结果表明，SELNs在口腔和胃酸环境中可维持囊泡结构，在肠液中开始破裂，释放活性成分，可保证消化稳定性。
04
SELNs对线虫存活率的影响
考虑到后期诱导线虫高脂模型需要7 d的培养时间，采用双盲实验记录了SELNs在7 d内线虫存活和死亡的情况。由图4可知，当SELNs的质量浓度为1、5、10、50、100 μg/mL时，线虫从L4期开始连续培养5 d，未出现死亡；培养7 d后，10、50、100 μg/mL SELNs处理组线虫虽然出现少量死亡，但是存活率均大于93%。然而，培养7 d后，200 μg/mL和500 μg/mL SELNs处理组线虫死亡数量增加，存活率低于90%，且呈现显著下降的趋势。基于此，后续实验采用的SELNs质量浓度设置为1、5、10、50、100 μg/mL。
05
SELNs对线虫体内脂滴生成的影响
采用油红O对线虫染色，可直接观察到线虫体内脂滴。如图5A、B所示，与对照组相比，SP诱导后线虫体内油红O的信号强度显著增强，说明高脂模型构建成功。与SP组相比，随着SELNs质量浓度增加，线虫体内油红O信号强度呈现递减的趋势，说明SELNs处理有助于抑制线虫体内脂滴生成，并呈剂量依赖性。同时，采用尼罗红染色进行激光共聚焦成像，进一步观察脂滴的大小和数量。如图5C、D所示，对照组线虫体内有60%的脂滴直径集中在0.9～1.6 μm范围内；SP诱导组线虫体内的脂滴直径集中在1.7～2.5 μm（占45%），与其他组相比，在此直径范围中的脂滴数量最多，且在2.6～3.5 μm范围内的脂滴数量也最多（占17%）。随着SELNs质量浓度增加，直径在1.7～2.5 μm和2.6～3.5 μm范围内的脂滴数量显著减少，0.9～1.6 μm范围内的脂滴数量显著增加，说明SELNs处理后可抑制大脂滴的生成。这两项结果说明，SELNs可抑制脂滴生成，减少脂质沉积。
06
SELNs对线虫TG含量的影响
TG是体内储量最大和产能最多的能源物质，然而，过多的TG会导致脂肪细胞功能改变。如图6所示，SP诱导组线虫体内的TG含量显著高于对照组（
P＜0.05），这与油红O染色结果相印证。与SP诱导组相比，经低剂量SELNs（1、5 μg/mL）作用后线虫体内的TG含量无显著变化，随着SELNs质量浓度增加，TG含量开始显著下降；当SELNs质量浓度达到100 μg/mL时，TG含量从SP诱导组的（0.35±0.03）mmol/g降低至（0.28±0.01）mmol/g，与对照组线虫体内TG含量（（0.28±0.02）mmol/g）持平。进一步验证了摄入适量的SELNs对线虫体内TG的合成具有抑制作用。
07
SELNs对线虫脂质代谢相关基因的影响
线虫体内约有400 个基因与脂肪积累高度相关，这些靶基因参与线虫脂质代谢的关键步骤。线虫脂肪合成的关键步骤是单不饱和脂肪酸的合成，其中Δ9脂肪酸去饱和酶（fatty acid desaturase，FAT）发挥重要作用。
fat-5是一种将棕榈酸转化为棕榈油酸的棕榈酸去饱和酶基因，
fat-6
fat-7是将硬脂酸转化为油酸的硬脂酸去饱和酶基因。如图7A～C所示，与对照组相比，SP诱导后显著上调线虫体内
fat-5（1.34 倍）、
fat-6（2.07 倍）和
fat-7（1.68 倍）mRNA的相对表达水平。与SP诱导组相比，SELNs的加入显著下调脂肪酸合成途径中
fat-5
fat-6
fat-7基因的表达，当SELNs质量浓度在1～50 μg/mL范围时，
fat-6
fat-7mRNA的相对表达水平呈浓度依赖性的下降趋势；
fat-5mRNA的相对表达水平虽然随着SELNs摄入量的增加呈波动变化，但整体呈显著下降的趋势，特别是在100 μg/mL SELNs作用下，与SP诱导组线虫相比，
fat-5mRNA的相对表达量降低了72%。据报道，植物活性物质可通过降低线虫
fat-5
fat-6的表达抑制脂肪堆积，这与本研究结果类似。由此可说明SELNs减少脂滴生成与抑制脂肪合成途径密切相关。
另外，磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPK）是调节能量代谢平衡的营养传感器和能量感受器。其中，
aak-2编码了一个负责AMPK活性的亚基，AMP与ATP比例增加可激活线虫内
aak-2表达，从而促进脂肪分解代谢。此外，
aak-2的活化也可阻止多不饱和脂肪酸的合成，主要是通过减少线虫体内单不饱和脂肪酸向多不饱和脂肪酸转化过程中限速酶基因的表达，如
fat-5
fat-6
fat-7。如图7D所示，与对照组相比，SP诱导组线虫
aak-2mRNA的相对表达水平下调了24%；当摄入SELNs后，
aak-2mRNA的相对表达水平显著增加，SELNs质量浓度为50 μg/mL时变化最显著，上调了约24 倍。有研究报道，植物活性成分如(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯、白藜芦醇和肉桂醛等可激活AMPK，提高代谢水平，从而减少脂质积累。基于此，推测SELNs可通过能量消耗增强脂肪的分解。
叉头转录因子
daf-16是胰岛素/胰岛素样生长因子信号（IIS）通路中
daf-2下游基因的关键转录因子，该通路参与调控线虫能量稳态和寿命。通过激活
daf-2可阻止
daf-16的核易位，导致
daf-16的磷酸化和失活。如图7E所示，与SP诱导组线虫相比，摄入SELNs后
daf-2mRNA的相对表达量显著增加，尤其是在50 μg/mL SELNs作用下，
daf-2mRNA相对表达量增加了18 倍。虽然
daf-2mRNA相对表达量随SELNs质量浓度的增加呈波动变化，但是其相对表达量仍然远高于SP诱导组，这可能与高浓度下SELNs存在双向调节作用有关。由图7F可知，SP诱导组线虫
daf-16mRNA的相对表达水平与对照组相比显著上调1.57 倍。摄入SELNs后，与SP诱导组相比，1～100 μg/mL SELNs给药组的
daf-16mRNA相对表达水平分别降低了61%、67%、79%、73%、62%。由此可推断，SELNs在调节脂质代谢过程中与IIS也有关。
结论
本研究从大豆中成功分离纯化出SELNs，其主要由脂质、蛋白质、核酸组成，经鉴定SELNs含有40 种脂质。SELNs在口腔和胃液模拟液中的囊泡结构较为稳定，在肠液模拟液中开始破裂，验证了SELNs具有的结构优势可规避消化道不良的恶性环境，到达肠道发挥生物活性。虽然SELNs所含脂质中TG含量最高，但是实验结果表明，摄入适量SELNs可显著抑制线虫体内脂滴的生成，有效缓解SP诱发的脂质沉积，这一发现可促使学者深入探究SELNs对脂肪代谢的调节作用。通过转录组基因分析可以推断，摄入SELNs可直接下调SP诱导的单不饱和脂肪酸合成相关基因（
fat-5
fat-6
fat-7）相对表达水平的升高，抑制脂肪酸合成；上调AMPK同源基因
aak-2的表达，提高机体的代谢水平；上调IIS通路关键基因
daf-2表达的同时下调
daf-16表达，增强脂肪分解能力，促进线虫的脂质代谢。因此，本研究证实了SELNs潜在的降脂功能，有望提高大豆衍生产品的高附加值，为肥胖及相关代谢综合征的预防提供新思路。
作者简介
通信作者：
朱珍珠 博士
南京财经大学 食品科学与工程学院 校聘副教授/硕导
朱珍珠博士，2019年至今，南京财经大学，食品科学与工程学院，校聘副教授，硕士生导师。2016年，博士毕业于南京大学，后进入生物学博士后流动站从事科研工作。目前，研究方向主要集中在果蔬来源胞外囊泡跨物种调控作用及其对人体健康的促进作用研究。入选南京财经大学“攀登计划”人才和“青年学者支持计划”。主持国家自然科学基金1项；参与国家自然科学基金面上项目1 项；主持横向课题4项；主持江苏省乡村振兴软课题1项。2016年入选全国首批“博士后创新人才支持计划”，曾获得中国博士后科学基金面上资助项目1项。近年来发表SCI论文20余篇，包括
Angewandte Chemie International Edition
Chemical Science
Inorganic Chemistry
Food & Function
European Journal of Medicinal Chemistry
Journal of Food Science
RSC Advances等，北大中文核心4篇。
Food Chemistry
Food & Function
Molecular Pharmaceutics等期刊审稿人。多次参加国内外学术会议并做报告。兼任
International Association of Dietetic Nutrition and Safety(国际食物营养与安全协会)秘书。江苏省科技镇长团成员（挂职）。
第一作者：
高铭蔚
南京财经大学 食品科学与工程学院
高铭蔚，2021年6月本科毕业于南京晓庄学院食品科学学院，2022年9月至今，硕士就读于南京财经大学食品科学与工程学院。课题研究方向为植物胞外囊泡改善脂质代谢紊乱的作用机制研究。2023年至今，主持江苏省研究生科研创新计划1 项，已发表SCI论文1 篇，北大核心期刊2 篇。
本文《大豆外泌体样囊泡对高脂线虫模型脂质代谢的调控作用》来源于《食品科学》2024年45卷22期，作者：高铭蔚,张梓文,朱珍珠。DOI：10.7506/spkx1002-6630-20240424-221。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
实习编辑：彤禾；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网
为深入探讨未来食品在大食物观框架下的创新发展机遇与挑战，促进产学研用各界的交流合作，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心、国家市场监督管理总局技术创新中心（动物替代蛋白）及中国食品杂志社《食品科学》杂志、《Food Science and Human Wellness》杂志、《Journal of Future Foods》杂志主办，西华大学食品与生物工程学院、四川旅游学院烹饪与食品科学工程学院、西南民族大学药学与食品学院、四川轻化工大学生物工程学院、成都大学食品与生物工程学院、成都医学院检验医学院、四川省农业科学院农产品加工研究所、中国农业科学院都市农业研究所、四川大学农产品加工研究院、西昌学院农业科学学院、宿州学院生物与食品工程学院、大连民族大学生命科学学院、北京联合大学保健食品功能检测中心共同主办的“第二届大食物观·未来食品科技创新国际研讨会”即将于2025年5月24-25日在中国 四川 成都召开。
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