纸片扩散法在药物敏感性试验中的应用

药物敏感性试验（AST）简称药敏试验（或耐药试验），旨在了解病原对各种药物的敏感（或耐受）程度，以指导药物治疗中合理选用药物的微生物学试验。某种药物如果能以很小的剂量抑制、杀灭病原，则称该种病原对该药物“敏感”。反之，则称为“不敏感”或“耐药”。为了解致病原对哪种药物敏感，以合理用药，减少盲目性，就应该进行对致病生物进行药敏试验。

一、实验材料

1. 培养基

一般情况下采用MH琼脂培养基进行，具体配制方法参照说明书进行。做不同细菌的药敏试验可选择不同的培养基，比如做链球菌的药敏试验可选择脑-心浸萃液琼脂培养基。

制备MH琼脂平板具体要求： 应用直径90mm平皿，在水平的实验台上倾注。琼脂厚4±0.5 mm(25～30 mL培养基)，凝固后用密封袋包装放4℃保存，在5天内用完，使用前应在37℃培养箱烤干平皿表面水滴，但要保持琼脂表面潮湿。

2. 实验菌株

待做药敏试验的细菌，必须是已纯化新鲜菌株 (图1)。

图1 已纯化新鲜菌株

3. 药敏纸片

(1) 购买商品化药敏纸片 (图2)。

图2 药敏纸片

(2) 自制药敏纸片。

采用新华1号定形滤纸，用打孔机打成6mm直径的圆形小纸片。取圆纸片50片放入清洁干燥的小瓶或者平皿中，以单层牛皮纸包扎。经121℃ 20min高压消毒后，放在37℃温箱或烘箱中数天，使其完全干燥 (图3、图4)。

图3 打孔机制备小纸片

图4 单层牛皮纸包扎

抗菌药的稀释剂通常用无菌蒸馏水，一般按照商品药物使用说明书上配料，按1g需加多少毫升水，就相当于配制药液所加蒸馏水的毫升数。比如10g药物可配50kg药液，其换算方法是：1g本品加5000mL蒸馏水，此溶液即为用于药敏试验的药液。

按每张纸片饱和吸水量为0.001mL计算，在上述含有50片纸片的小瓶或平皿内加入药液0.5mL，不时翻动，使滤纸片将药液均匀吸净，一般浸泡30min即可 (图5)。

图5 纸片浸泡药液

同时记录药物名称，于37℃干燥箱过夜。在干燥箱中的时间不宜过长，以免某些药物失效。

图6 室温放置后取出药敏纸片

(3) 药敏纸片的保存。

药敏纸片应保存在干燥环境，可在-20℃长期储存，日常使用的小量纸片可在4℃保存，时间不超过1周。使用时从低温取出后，放置到室温后才可打开，剩余未用完的应立即放回冰箱内的密闭容器内 (图6)。过期纸片不能使用，应弃去。

二、实验操作方法

1.将待检菌接种于MH琼脂培养基，37℃培养16～18h或根据菌株生长的需要进行培养，然后无菌操作挑取琼脂平板上的纯培养菌落，置于3mL无菌生理盐水中，混匀后与菌液比浊管比浊，调整浊度与比浊管 (0.5麦氏单位)相同 (图7、图8)。

图7 挑取纯培养菌落

图8 调整菌液浊度

2.在无菌操作台中，用无菌棉拭子蘸取菌液，在管壁上挤压去掉多余菌液。用棉拭子涂布整个培养基表面，反复几次，每次将平板旋转60°，最后沿周边绕2圈，确保涂布均匀 (图9至图12)。

图9 无菌棉拭子蘸取菌液

图10 管壁上挤压去掉多余菌液

图11 涂布培养基表面

图12 沿周边涂布

3.待平板上的水分被琼脂完全吸收后再贴纸片。用无菌镊子取药敏纸片贴在平板表面，纸片一贴就不可再拿起。为了使药敏片与培养基紧密相贴，可用镊子轻按几下药敏片。每个平板贴6张纸片，每张纸片间距不少于24mm，纸片中心距平皿边缘不少于15mm，在菌接种后15min内贴完纸片 (图13)。

图13 药敏纸片贴在平板表面

4.将平板在室温放置20～30min，以利于药敏纸片上的药物充分扩散。

5.将平板反转，28℃恒温培养16～18h，观察结果。

三、结果观察

1.测量抑菌圈：手持平板从背面目测检查，借助游标卡尺、普通尺等测量抑菌环直径，抑菌环直径需包含纸片直径，单位为毫米，测量最接近的整数毫米数并记录 (图14)。

图14 测量抑菌圈直径

2.抑菌环的边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限。有的菌株可出现蔓延生长，进入抑菌环，磺胺药在抑菌环内出现轻微生长，这些都不作为抑菌环的边缘。

3.在涂有细菌的琼脂平板上，抗菌药物在琼脂内向四周扩散，其浓度呈梯度递减，因此在纸片周围一定距离内的细菌生长受到抑制。过夜培养后形成一个抑菌环，抑菌环越大，说明该菌对此药敏感性越大，反之越小，若无抑菌环，则说明该菌对此药具有耐药性。其直径大小与药物浓度、涂布细菌浓度有直接关系。

4.结果判断依据鉴定所选药敏纸片判定标准。

来源：水产百科，内容有修编

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