上海
RAS蛋白是大小约21 kDa的小GTPase家族成员，有KRAS，HRAS和NRAS三种亚型，结合GTP后呈现活化形式。在GTPase激活因子 （GTPase-activating proteins，GAPs） 的作用下，RAS蛋白将GTP水解成GDP从而失活，而鸟嘌呤交换因子 （Guanine nucleotide exchange factors，GEFs） 将GDP替换为GTP再度活化RAS。这种结合GTP活化、结合GDP失活的转换过程保证了RAS蛋白有序地将细胞外的生长信号传导至细胞内，使得下游MAPK以及PI3K/AKT的活化处于可控状态，维持组织细胞的正常增殖【1】。RAS功能获得性突变使其始终处于GTP结合的活化状态，持续激活MAPK以及PI3K/AKT信号通路，导致细胞恶性增殖。大约20%–25%的人类癌症携带RAS致癌突变，其中KRAS突变约占RAS突变的85%，常见于包括非小细胞肺癌、胰腺癌和结直肠癌在内的多种癌症中，且多发生在第十二位或第十三位的甘氨酸上【1-3】。由于KRAS对GTP/GDP的亲和力在皮摩尔级，细胞内的GTP/GDP浓度在微摩尔级，其表面也缺乏可靶向的口袋，因此开发直接靶向KRAS的抑制剂异常困难。目前仅有KRASG12C的抑制剂 （索托拉西布、阿达格拉西布、格索雷塞、氟泽雷塞等） 上市，靶向KRAS其它致癌突变的抑制剂的开发依然困难重重【3-6】。因此，通过间接的方式如调节KRAS的翻译后修饰从而调控其稳态与活性，可作为针对KRAS突变相关癌症的靶向治疗策略【3-6】。
2025年2月13日，武汉大学中南医院医学研究院/生命科学学院钟波教授与武汉大学人民医院林丹丹教授课题组合作在Dev Cell上发表了题为KRAS4B oncogenic mutants promote non-small cell lung cancer progression via the interaction of deubiquitinase USP25 with RNF31的研究论文，发现去泛素化酶USP25抑制RNF31对KRAS致癌突变的线性泛素化修饰，促进KRAS突变介导的非小细胞肺癌进展，为治疗KRAS致癌突变驱动的非小细胞肺癌提供了潜在的生物标志物与药物靶点。
为了探究是否存在特异性靶向KRAS致癌突变的去泛素化酶，研究者首先筛选了特异与KRASG12D相互作用的去泛素化酶，发现USP25特异性结合KRASG12D而非野生型KRAS。在KrasLSL-G12D/+Lkb1fl/fl （KL） 和KrasLSL-G12D/+Tp53fl/fl （KP） 原发非小细胞肺癌小鼠模型以及多种人KRASmut肺癌细胞系异体移植模型中，敲除USP25显著抑制肿瘤进展，促进KRASmut的泛素化，但不影响KRAS的蛋白表达水平。转录组测序和蛋白质印迹分析结果表明，敲除USP25显著下调肿瘤细胞中的RAS信号通路，抑制KRAS下游MAPK以及AKT的活化。此外，为了探究USP25对小鼠非小细胞肺癌的促进作用是否依赖其去泛素化酶活，研究者还构建了USP25酶活缺失的KrasLSL-G12D/+Tp53fl/flUsp25C178A/C178A （KP25CA） 小鼠，发现USP25酶活的缺失并不会影响KP小鼠的肿瘤生长，也不影响KRasG12D的泛素化与稳定性，说明USP25以酶活非依赖的方式抑制KRAS突变的非降解型泛素化修饰，促进非小细胞肺癌进展。
由于USP25能以酶活非依赖的方式抑制KRASmut的泛素化水平并促进肺癌进展，研究者推测USP25和USP25C178A通过抑制E3连接酶催化KRASmut发生泛素化修饰，或作为桥梁蛋白促进其它去泛素化酶去除KRASmut上的泛素链。这样的E3连接酶或去泛素化酶能够结合KRASmut，USP25和USP25C178A，且USP25和USP25C178A均能抑制E3连接酶和KRASmut的结合，或促进去泛素化酶与KRASmut的相互作用。以此推测为基础的质谱筛选以及后续免疫共沉淀实验鉴定到E3连接酶RNF31与KRASG12D相互作用，并诱导KRASG12D发生线性泛素化修饰，该过程依赖于RNF31的酶活功能。随后研究者进一步发现USP25或USP25C178A通过竞争性结合RNF31的N端结构域，从而抑制了RNF31和KRASG12D的相互作用，以及RNF31介导的KRASG12D的线性泛素化修饰。
为了探究USP25和RNF31调控KRASG12mut的生理学意义，研究者紧接着构建了野生型、USP25敲除、RNF31敲除和USP25/RNF31双敲除的A549细胞系，以及KrasLSL-G12D/+Tp53fl/flRnf31fl/fl （KP31cKO） 和KrasLSL-G12D/+Tp53fl/flRnf31fl/flUsp25-/- （KP25/31cKO） 小鼠。原位肺癌模型和移植瘤模型结果均表明，敲除RNF31能够回复USP25敲除的非小细胞肺癌的进展，抑制KRASmut的泛素化。此外，免疫共沉淀、免疫荧光以及小鼠皮下成瘤等实验结果显示，在USP25缺失的情况下，RNF31能够催化KRASG12D上第175-180位赖氨酸发生泛素化修饰，并阻碍KRASG12D的质膜定位，使其聚集在胞质中无法发挥正常功能。进一步敲除RNF31、用药物抑制RNF31酶活或将K175-780突变为R175-180均能使KRASG12D重新定位到质膜上，促进下游信号通路以及肿瘤进展。
综上所述，本研究揭示了USP25和RNF31通过调控KRAS致癌突变的线性泛素化修饰，改变KRAS突变的质膜定位，从而调控非小细胞肺癌进展的作用机制，为治疗KRASG12mut驱动的非小细胞肺癌提供了新的潜在靶点和干预策略。
武汉大学中南医院医学研究院/生命科学学院钟波教授、武汉大学人民医院林丹丹教授、武汉大学人民医院汪巍副主任医师为本研究的通讯作者，武汉大学生命科学学院博士生杨慈和武汉大学医学研究院博士生李洪旭为该论文的共同第一作者。本研究得到了清华大学基础医学院林欣教授，武汉大学医学研究院张金方教授和殷昊教授的帮助与支持。
https://doi.org/10.1016/j.devcel.2025.01.015
制版人：十一
参考文献
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