专家点评Nat Chem Bio丨苏文静/谢伟合作揭示ARAF调控RAS活性的分子机理及其在肿瘤耐药中的功能

点评 | 刘雨嫣/李丕龙（ 北京大学）、高益军/康铁邦（中山大学）

RAS-RAF-MAPK通路作为经典的丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK） 信号通路，是多种膜受体传导的生长信号跨膜传递的交汇点，参与细胞的增殖、分化、凋亡、炎症反应等多种生理过程。处于持续激活状态下的RAS-RAF-MAPK通路通常会造成细胞增殖或分化异常，因此，该通路中各成员蛋白的突变和异常表达与多种恶性肿瘤的发生发展密切相关。作为该通路的核心传导因子，RAF蛋白有三个异构体，分别为ARAF、BRAF和CRAF，它们均参与将RAS的激活信号传递至下游的MEK/ERK。目前，大量研究都集中在BRAF和CRAF功能及突变体分析上，而ARAF的生物学功能却鲜为人知。课题组在前期的研究工作中发现，与BRAF和CRAF不同，ARAF能够以一种不依赖于其激酶活性的方式反向激活RAS （PMID: 35613620） 。然而，尽管三个RAF亚型都能与RAS-GTP结合，并且都具有高度保守的RAS结合域，但尚不清楚为什么只有ARAF能够引发RAS激活。这为RAF靶向疗法的开发带来了显著挑战。

2025年1月17日，浙江大学生命科学研究院苏文静课题组与药学院谢伟课题组合作，在Nature Chemical Biology杂志在线发表了题为Plasma membrane-associated ARAF condensates fuel RAS-related cancer drug resistance的研究长文，解析了ARAF亚型特异性功能背后一个此前未被认识到的分子基础，揭示了ARAF对RAS活性的调控在病理条件下的生物学功能，为靶向该通路的异常调控提供新思路和科学依据。

在该工作中，研究人员通过比较三个RAF蛋白的亚细胞定位，观察到ARAF表现出明显的细胞膜定位，并且在细胞膜附近呈现出不均匀的类胶状聚集。进一步确定与ARAF特异性膜定位相关的结构域，研究人员发现ARAF的N端18个氨基酸组成的无序区介导了ARAF-RAS凝聚体的形成。这些凝聚体可以导致细胞膜局部RAS浓度上升，保护RAS-GTP免受GTPase活化蛋白 （GTPase activating protein，GAP） 依赖的负向调控，同时放大受体酪氨酸激酶 （Receptor tyrosine kinase，RTK） 等细胞表面受体触发的RAS激活。通过这一机制，ARAF凝聚体在细胞内的丰度决定了RAS-GTP水平以及对RAS信号通路抑制剂的敏感性。值得注意的是，在携带RAS突变的肿瘤细胞中，泛RAF抑制剂能够有效抑制ARAF N端缺失细胞的增殖，而表达野生型ARAF的亲代细胞则对治疗表现出耐药性。此外，在激素依赖型肿瘤中，ARAF-RAS凝聚体能够促进RAS依赖的内分泌治疗耐药。

图1. ARAF通过其N端无序区介导的凝聚体来维持RAS活性并促进肿瘤耐药

这一发现对于肿瘤靶向治疗来说具有重要意义，它揭示了ARAF的一种新型致癌机制：通过其N端介导ARAF-RAS凝聚体的形成导致RAS的持续性激活。这意味着ARAF可能成为逆转肿瘤耐药的关键治疗靶点。但需要强调的是，ARAF促进RAS活性的功能不依赖于激酶活性，而目前针对RAF蛋白的广谱抑制剂主要基于激酶活性或RAF二聚化来进行设计。因此，这些抑制剂不会对ARAF功能起到有效抑制。鉴于ARAF在维持RAS-GTP水平以及RAS蛋白重激活中的关键作用，通过降解ARAF诱导的凝聚体或使用调节凝聚体形成的小分子化合物，可能为解决野生型和突变型ARAF介导的肿瘤耐药提供新的希望。

浙江大学生命科学研究院苏文静研究员，浙江大学药学院谢伟研究员，为论文共同通讯作者。博士研究生李雯，施潇娴，谭采薇为共同第一作者。

https://www.nature.com/articles/s41589-024-01826-8

苏文静课题组长期从事肿瘤耐药的机制研究，在Molecular Cell, Cancer Cell，Nature Medicine等期刊上发表多篇论文。课题组计划于2025年招聘1~2名博士后，要求有生命科学或基础医学等相关专业的研究背景，有肿瘤免疫研究经验者优先考虑。有意向者请投递简历至wenjingsu@zju.edu.cn，诚挚邀请热爱科研的人员加入！

专家点评

刘雨嫣/李丕龙（北京大学）

尽管近年来癌症治疗领域的新兴疗法方兴未艾，但肿瘤耐药仍是一个棘手的难题。浙大苏文静团队和谢伟团队的文章Plasma membrane–associated ARAF condensates fuel RAS-related cancer drug resistance围绕ARAF蛋白在RAS相关癌症耐药性中的作用展开研究，揭示了ARAF通过自我组装形成与细胞膜相关的凝聚体 （condensates） 的现象，ARAF通过这种方式促进RAS活性，从而导致癌症细胞对药物产生耐药性。本文的研究内容为理解肿瘤耐药的机制提供了新的思路，也为探索肿瘤耐药的治疗开辟了新策略，助力未来抗癌药物的开发。

RAF蛋白激酶是RAS/RAF/MAPK信号通路的重要组成部分。与BRAF和CRAF不同，ARAF蛋白可以在细胞膜上形成“固体样”凝聚体——这种凝聚体的形成依赖于ARAF蛋白的N端无序序列 （intrinsically disordered region, IDR） ，该区域是驱动自组装的关键。ARAF这种在细胞膜局部浓缩的相分离特性，使其能够与RAS及其他相关信号分子紧密互动，募集RAS激活的相关复合物，从而增强信号传递。

体外及体内实验均表明，依赖于其N端无序区，ARAF通过募集RAS形成膜上的ARAF-RAS颗粒，抑制GAP 蛋白NF1与RAS的结合。值得注意的是，这种效应不依赖于ARAF的激酶活性。使用同源寡聚标签 (HO-Tag) 系统的多价性驱动蛋白质凝聚，可以诱导N端缺失ARAF的聚集，恢复ARAF介导的RAS激活。这一机制表明，ARAF能够通过其N端介导的凝聚物形成来维持RAS的激活状态，显著增强RAS信号的激活时长。

当前的肿瘤治疗仍缺乏针对不同RAS突变的有效手段，通过下游通路抑制靶向突变RAS也收效甚微。由于ARAF依赖其N端序列具有维持RAS-GTP水平的能力，作者提出假设，ARAF–RAS凝聚体可能是RAS突变肿瘤对RAF抑制剂耐药的突破点。作者发现，敲除ARAF的N端可以显著提高RAS突变肿瘤细胞对泛RAF抑制剂的敏感性。在乳腺癌和前列腺癌模型中， RTK通路的激活是导致内分泌治疗耐药的重要原因。同样，ARAF-RAS聚集体的大量积累能够导致RTK-RAS通路的持续激活，从而对内分泌治疗产生耐药抵抗。这一结果进一步表明ARAF-RAS聚集体是RAS依赖的肿瘤耐药的一个普遍机制。该结果揭示了ARAF凝聚体在癌症耐药性中的关键作用，提示通过抑制ARAF凝聚体形成可能是解决耐药的一种新策略。

本研究证明了RAF蛋白激酶家族成员ARAF在不依赖其激酶活性及二聚化的情况下，通过其N端介导的自组装能力及其结合RAS的能力，形成膜相关的ARAF-RAS聚集体，从而增强RAS的激活。这揭示了RAF异构体特异性功能的结构基础，即ARAF 内在无序序列的重要作用。该机制为ARAF介导的RAS激活提供了宝贵的见解，并为理解膜相关蛋白颗粒在调节信号转导中的作用提供了一个创新模型。ARAF的功能在不同的癌症背景中具有相似性，其表达水平可作为潜在的临床预后指标。此外，面对传统意义上的“不可成药”靶点，本研究另辟蹊径，为癌症耐药性机制研究和治疗干预提供了新思路。根据本文的研究，针对ARAF凝聚体开发抑制性药物可能是治疗肿瘤耐药的突破点，尤其是在当前治疗手段疗效有限的癌症中具有极大的潜力。

专家点评

高益军/康铁邦（中山大学肿瘤防治中心）

RAS/MAPK信号通路通过RAF、MEK和ERK三级蛋白激酶的磷酸化级联反应，将细胞外刺激信号传递至细胞内，调控细胞的存活、增殖和分化等关键生物学过程。作为RAS下游的关键信号蛋白，RAF激酶包括ARAF、BRAF和CRAF三种亚型，在RAS激活后，这些亚型能够形成同源或异源二聚体，并通过磷酸化MEK激活下游信号通路。BRAF突变在RAF家族中最为常见，发生于7%至10%的肿瘤中，因此成为抗肿瘤药物研发的重要靶点。靶向BRAF V600E热点突变的抑制剂在黑色素瘤等肿瘤的临床治疗中表现出显著疗效，但耐药性和肿瘤复发仍是主要挑战。研究表明，RAS突变或反馈激活导致的RAF二聚化是BRAF V600E突变型肿瘤对现有RAF抑制剂产生耐药的主要机制。靶向RAF二聚体的第二代RAF抑制剂已进入临床试验阶段，并在BRAF和RAS突变型肿瘤中表现出一定的治疗潜力。近期研究发现，在RAS突变型肿瘤中，ARAF通过其激酶活性和二聚体依赖的方式驱动肿瘤对RAF二聚体抑制剂的耐受。浙江大学生命科学研究院苏文静课题组的研究发现，ARAF通过竞争性抑制RAS GAP蛋白NF1与RAS的结合，维持RAS的持续激活状态，从而导致EGFR突变型非小细胞肺癌对EGFR TKI治疗产生获得性耐药。值得注意的是，ARAF对RAS的激活并不依赖其激酶活性，但其具体分子机制尚待进一步研究。

在本研究中，苏文静课题组与浙江大学药学院谢伟课题组合作，深入解析了ARAF区别于其他RAF亚型调控RAS活化的分子机制。研究人员通过免疫荧光、免疫电镜以及膜组分分离等实验，发现ARAF能够在细胞膜附近形成类胶状凝聚体。进一步通过构建N端截短体及突变体实验表明，ARAF的N端无序区介导了ARAF–RAS凝聚体的形成。通过将ARAF的N端无序区置换至BRAF或CRAF上，研究人员成功使原本无法形成凝聚体的BRAF或CRAF重新具备自组装能力。相反，N端缺失的ARAF无法组装形成凝聚体，进而无法募集并激活RAS。而通过HO-Tag系统强制诱导N端缺失的ARAF组装，能够恢复RAS的募集和活化。这些实验结果证实了ARAF–RAS凝聚体的形成依赖于两个关键因素：ARAF的自组装能力及其结合RAS的能力。ARAF通过形成ARAF–RAS凝聚体，将RAS与其GAP NF1隔绝开来，使得RAS保持持续激活状态。

该研究进一步探讨了ARAF介导的RAS激活在肿瘤耐药中的作用。研究发现，敲除ARAF或其N端无序区显著提高了KRAS突变型肺癌细胞对RAF二聚体抑制剂的敏感性。研究还验证了ARAF介导的凝聚体在激素依赖性乳腺癌和前列腺癌内分泌治疗耐药中的功能：ARAF的过表达能够通过凝聚体的形成激活RAS驱动内分泌治疗耐药，而N端自组装缺陷型突变 （ARAF(P/F)） 失去了这一能力。

本研究不仅揭示了ARAF介导RAS活化的新机制，还为克服ARAF介导的肿瘤耐药提供了理论依据。RAS的异常激活在RTK驱动型肿瘤及激素依赖性肿瘤的靶向治疗耐药中发挥重要作用，ARAF通过ARAF–RAS凝聚体的形成诱导RAS持续激活，可能是一种广谱耐药机制。因此，干扰ARAF–RAS凝聚体的形成有望成为克服ARAF介导耐药的新策略。值得注意的是，RAS在近20%的肿瘤中存在激活突变，目前获批的KRAS G12C特异性抑制剂通过结合KRAS-GDP并将KRAS锁定在失活状态发挥抑制作用。ARAF诱导的ARAF–KRAS凝聚体形成及KRAS-GTP的激活可能通过降低细胞内KRAS-GDP水平而导致KRAS G12C抑制剂耐药。目前针对RAS-GTP的新型抑制剂正处于临床开发阶段，ARAF–RAS凝聚体是否会影响RAS-GTP抑制剂在RAS突变肿瘤中的疗效值得进一步研究。

制版人：十一

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