《食品科学》：江南大学食品学院孙嘉教授等：高产胆盐水解酶乳杆菌的筛选及对新生大鼠黄疸的防治作用

新生儿黄疸（NJ）是新生期常见症状，大约60%的足月婴儿和80%的早产儿在出生后早期出现不同程度的黄疸。NJ患者易出现组织被染成黄色，伴有食欲不振、腹泻或便秘等消化道症状，甚至出现胆红素脑病引起神经系统后遗症或死亡。NJ是由体内非结合胆红素产生过多，而肝脏代谢能力不足所致，作为将非结合转红素转化为结合胆红素的唯一关键酶UGT1A1，在新生儿体内表达量仅为成人的10%。因此，调控胆红素代谢的关键酶UGT1A1可能成为预防NJ的关键策略。

胆盐水解酶（BSH）是一种由微生物产生将肝脏来源的结合胆汁酸解偶联为游离胆汁酸的酶。其中乳杆菌作为产生BSH的主要微生物，在维持肠道中胆汁酸池的稳态和人体健康方面起着至关重要的作用，并且BSH在菌种和菌株之间存在巨大的底物差异。与正常人相比，NJ患者肠道中乳杆菌的相对丰度明显下降，并伴随胆汁酸代谢紊乱。因此，补充乳杆菌重塑肠道微生态及维持胆汁酸代谢平衡可能是NJ的潜在干预策略。

江南大学食品学院的张慧敏、李彬彬、孙嘉*等鉴于BSH在胆汁酸代谢调控中的重要作用以及游离胆汁酸可激活核转录因子上调胆红素代谢酶UGT1A1的潜在效应，筛选高产BSH的乳杆菌菌株，并探究其对NJ的防治作用，以期为NJ相关益生菌补充剂的开发提供参考。

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乳杆菌的筛选及鉴定

将22 份婴儿粪便和10 份母乳样本进行菌体富集，涂布到添加制霉菌素的LBS选择性培养基上，筛选得到潜在乳杆菌属的菌落，代表性潜在乳杆菌菌落如图1A所示。根据菌落的大小、形态、颜色、边缘等初步归类，每种菌落经过二次划线纯化挑取单菌落，用乳杆菌的特异性引物进行PCR鉴定，依据在500 bp处的特异性扩增条带共获得25 株乳杆菌（图1B）。基于NCBI-BLAST网站序列比对，共分离获得20 株乳杆菌（表2），包括植物乳杆菌10 株、发酵乳杆菌（Limosilactobacillus fermentum）3 株、罗伊氏乳杆菌（Limosilactobacillus reuteri）3 株、格氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri）1 株、鼠李糖乳杆菌（Lacticaseibacillus rhamnosus）1 株、副干酪乳杆菌（Lactobacillus paragasseri）1 株和短乳杆菌（Levilactobacillus brevis）1 株。

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乳杆菌益生特性

2.1 乳杆菌对致病菌的抑制能力

抑制病原微生物定植或生长能力是益生菌的标志性特征，也是评价益生特性的基础。如表3所示，筛选获得的20 株乳杆菌对4 种致病菌有较好的抑制能力。其中菌株Y4不能抑制肠道沙门氏菌（

Salmonella enterica

Staphylococcus aureus

Listeria monocytogenes

2.2 乳杆菌对模拟消化液的耐受能力

益生菌进入人体后会经受胃液低pH值、肠液中胆盐和消化酶等胃肠道环境的干扰，因此，菌株在消化液中的存活能力是发挥功效的前提。本实验进一步评估了上述16 株乳杆菌对模拟消化液的耐受能力，结果如图2所示。相比于在肠液中存活率为53.84%的鼠李糖乳杆菌LGG，菌株Y1-1、Y1-2、Y2-1、Y2-2、YXC、WSN-1、FWJL-5、MWSN-2、MYXC-1、MYQQ-2对模拟消化液的耐受性更强，表明这10 株乳杆菌在模拟消化液中有较高的存活能力。

2.3 乳杆菌对人肠上皮Caco-2细胞的黏附能力

乳杆菌能附着在胃肠道上占据致病菌的黏附受体，通过抑制某些细菌病原体的生物膜形成防止病原菌的入侵和增殖，从而维持肠道微生物群的平衡。图3显示了菌株对Caco-2细胞的黏附能力，阳性对照LGG的黏附率为42.05%，相比于LGG，菌株Y1-2、Y2-2、WSN-1、FWJL-5、MYXC-1、MYQQ-2对Caco-2细胞的黏附能力更强，表明这6 个菌株在体外表现出良好的黏附能力。

2.4 乳杆菌对抗生素的敏感性

筛选所得乳杆菌对8 种抗生素的敏感性如表4所示，Y1-1和MWSN-2对链霉素的耐受性很高，LYZ-1对卡那霉素的耐受性很高，其余菌株对抗生素有着较好的敏感性，表明这些菌株具有作为活菌产品的潜力。

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乳杆菌产BSH活性评价

通过上述乳杆菌益生特性实验，共获得6 株在抑制肠道致病菌、耐受模拟消化液、黏附人肠上皮Caco-2细胞、对抗生素的敏感性方面表现均优于LGG，用于后续高产BSH乳杆菌菌株的筛选。表5为乳杆菌中BSH解偶联结合胆盐甘氨脱氧胆酸（GDCA）和牛磺脱氧胆酸（TDCA）活性的测定结果，结果表明，Y1-2、MYQQ-2和FWJL-5的两种结合胆盐水解能力均高于LGG。基于此，共筛选获得3 株具有良好益生特性且具有高产BSH能力的乳杆菌。由于格氏乳杆菌已有研究与新生儿胆汁淤积有关，故选取格氏乳杆菌FWJL-5进一步探究其对NJ的作用。

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格氏乳杆菌FWJL-5对新生大鼠黄疸的防治作用

体质量、血清颜色及胆红素水平是判断NJ严重程度的重要指标。如图4所示，与对照组相比，模型组新生大鼠体质量在造模期明显下降（P＜0.05），血清颜色加深，且总胆红素、结合胆红素、非结合胆红素水平均高度显著升高（P＜0.001）。与模型组相比，补充格氏乳杆菌FWJL-5可显著改善新生大鼠的体质量下降及溶血现象（图4A、B），同时高度显著降低了总胆红素和非结合胆红素水平（P＜0.001）（图4C、E），极显著降低了结合胆红素水平（P＜0.01）（图4D）。FWJL-5与LGG相比其改善效果更为明显。上述结果表明，格氏乳杆菌FWJL-5对PHZ诱导的新生大鼠黄疸具有防治作用。

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格氏乳杆菌FWJL-5对黄疸相关肝毒性的影响

PHZ诱导新生黄疸的发生过程中，主要受影响的脏器是肝脏，本实验通过比较肝脏颜色和肝脏组织病理学切片，评估PHZ对肝脏的损伤程度。如图5所示，与对照组相比，PHZ模型组的肝脏颜色明显变黑及组织溶血现象加重（图5A），肝脏组织病理学切片结果显示，PHZ处理显著加重肝脏水肿和溶血现象（图5B）。与PHZ模型组相比，FWJL-5干预组和LGG干预组的肝脏颜色偏红粉，显著改善了肝脏组织的水肿和溶血现象，且FWJL-5组相比于LGG组肝脏颜色更粉，组织水肿和溶血现象有更为明显的改善。

血清中AST、ALP、ALT、TBA含量是常用的反应肝脏损伤的标志物。如图5C～F所示，与对照组相比，PHZ模型组的ALT、AST在血清中的含量极显著上升（P＜0.01），ALP、TBA在血清中的含量高度显著上升（P＜0.001），表明在NJ发生过程中会导致肝脏损伤及产生肝毒性，经过LGG和FWJL-5处理后均抑制了与肝损伤相关酶和TBA的释放，且FWJL-5组的抑制效果较LGG组更明显，说明FWJL-5能有效改善PHZ引起的肝脏损伤和肝毒性。在NJ发生时，炎症因子的释放对炎症反应进程起到重要调控作用。本实验通过检测促炎因子肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-1β、IL-6和抑炎因子IL-10的mRNA相对表达量评估格氏乳杆菌FWJL-5对肝脏炎症的缓解作用。如图5G～J所示，与对照组相比，模型组中TNF-α mRNA相对表达量显著增加（P＜0.05），IL-1β、IL-6 mRNA相对表达量高度显著增加（P＜0.001），IL-10 mRNA相对表达量明显降低（P＜0.001），表明PHZ诱导的新生黄疸伴随着肝脏炎症的发生。补充格氏乳杆菌FWJL-5有效抑制了TNF-α、IL-1β、IL-6及促进了抑炎因子IL-10的表达，与阳性参照LGG相比，其效果更显著，表明乳杆菌FWJL-5能够缓解NJ发生过程中肝脏组织的炎症反应。

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格氏乳杆菌FWJL-5对核受体和UGT1A1表达的调控

核受体FXR、PXR、CAR作为UGT1A的上游核转录因子，能够调控UGT1A1的表达。如图6所示，PHZ造模后抑制了核转录因子mRNA的表达，同时降低了UGT1A1的表达。格氏乳杆菌FWJL-5干预极显著上调了PXR的mRNA表达水平（P＜0.01），高度显著上调了FXR的mRNA表达水平（P＜0.001），而对CAR的mRNA表达无显著影响（P＞0.05），同时高度显著增加了UGT1A1的表达（P＜0.001）。

结论

本研究从新生婴儿粪便和母乳中筛选出了20 株乳杆菌，经体外实验评价，其中6 株乳杆菌在抑制肠道致病菌能力、黏附Caco-2细胞能力、对模拟消化液的耐受性和对抗生素的敏感性方面均表现出优良的益生特性，并且4 株乳杆菌的BSH具有很强的水解结合胆盐GDCA和TDCA的能力，选取格氏乳杆菌FWJL-5用于新生大鼠黄疸疾病探究。动物实验结果表明，格氏乳杆菌FWJL-5能缓解PHZ引起的体质量下降、红细胞溶血现象，抑制血清中结合胆红素和非结合胆红素水平的升高，同时减轻肝脏细胞肿胀和炎症细胞浸润、抑制肝酶和总胆汁酸的释放。通过对胆红素代谢关键酶UGT1A1和上游核转录因子表达的分析，进一步证明格氏乳杆菌FWJL-5通过上调核受体FXR和PXR促进肝脏组织中UGT1A1的表达，促进非结合胆红素向结合胆红素转化，从而预防NJ的发展。本研究可为NJ的防治提供新策略，并为高产BSH的格氏乳杆菌在NJ的临床应用提供依据。

本文《高产胆盐水解酶乳杆菌的筛选及对新生大鼠黄疸的防治作用》来源于《食品科学》2024年45卷第11期118-127，作者：张慧敏，李彬彬，潘晓花，孙 嘉*。DOI :10.7506/spkx1002-6630-20231015-116。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑：农梦琪；责任编辑：张睿梅。点击下方 阅读原文 即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

为深入探讨未来食品在大食物观框架下的创新发展机遇与挑战，促进产学研用各界的交流合作，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心及中国食品杂志社《食品科学》杂志、《Food Science and Human Wellness》杂志、《Journal of Future Foods》杂志主办，西华大学食品与生物工程学院、四川旅游学院烹饪与食品科学工程学院、西南民族大学药学与食品学院、四川轻化工大学生物工程学院、成都大学食品与生物工程学院、成都医学院检验医学院、四川省农业科学院农产品加工研究所、中国农业科学院都市农业研究所、四川大学农产品加工研究院、西昌学院农业科学学院、宿州学院生物与食品工程学院、大连民族大学生命科学学院、北京联合大学保健食品功能检测中心共同主办的“第二届大食物观·未来食品科技创新国际研讨会”即将于2025年5月24-25日在中国 四川 成都召开。

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